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DNA
DNA聚合酶klenow限制性内切酶
水浴锅离心机培养箱
1. 制备模板(见基本方案,步骤1和2)
2. 合成和纯化寡核苷酸引物并对5‘端磷酸化。
3. 扩增模板DNA(基本方案,步骤4和5),在最后一次延伸结束后,加5 U 的klenow酶,30℃保温15 min。
4. 分析并处理反应产物(基本方案1,步骤6和7)。5. 取所得扩增片段的一半量用侧翼序列内的限制性内切酶切割,低熔点琼脂糖凝胶电泳 纯化酶切片段。
6. 将两个扩增的片段通过平末端连接亚克隆入合适的载体。7. 按基本方案1,步骤10、11进行。