痘苗DNA检测实验——斑点杂交法

NaOHTris • Cl2×SSCPBS胰酶／EDTA干冰／乙醇DNA 提取缓冲液乙酸钠乙醇PCR 扩增缓冲液引物完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培养基完全 MEM-10／BrdU 培养基筛选试剂4 dNTP 混合物MgCl2

硝酸纤维素膜Whatman 3 MM 滤纸80℃ 真空干燥箱24 孔组织培养板杯状超声仪

1. 病毒感染细胞并完成筛选（见「PCR 法」步骤 1~9）。

2. 轻轻刮下细胞，转移到离心管中，最大转速离心 30 s，弃培养基，用 200 μl PBS 重悬。24 孔培养板中的细胞也可用 1ml 的注射器的活塞刮取。

3. 冻融并超声细胞悬液（见「PCR 法」步骤 11、12）。

4. 将硝酸纤维素膜剪至适合点迹仪大小，将其用水浸湿，放入仪器中，每孔中加入 20~100 μl 的细胞悬液（步骤 3），用抽吸的方法使液体流过硝酸纤维素膜，随后将膜取出。

5. 剪 6 片 Whatman 3 MM 滤纸，使其稍大于硝酸纤维素膜，将一块 Whatman 3 MM 滤纸用 0.5 mol/L NaOH 浸湿。把硝酸纤维素膜放在湿润的滤纸上 1 min。移开硝酸纤维素膜，将其放在干燥的滤纸上 1 min。用同样的滤纸重复此步骤 2 次。使用镊子移开硝酸纤维素膜。

6. 用浸润过 1 mol/L Tris • Cl pH 7.5 溶液的滤纸按步骤 5 的方法处理硝酸纤维素膜 （每张膜 3 次）。

7. 用浸润过 2 × SSC 溶液的滤纸按步骤 5 的方法处理硝酸纤维素膜（每张膜 3 次）。

8. 用 80℃ 真空干燥箱烘烤硝酸纤维素膜 2 h。

9. 进行 DNA 杂交。

1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养，除非有特殊说明。

2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。