从培养细胞中分离的细胞核制备成的提取物在体外转录和mRNA加工中具有精确的功能,(1)纯化蛋白质(2)核提取物。
实验方法原理 | 通过向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后,可以降低蛋白质的溶解度,使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析,是物理变化,可复原。对于特定的蛋白质,影响蛋白质盐析的主要因素:无机盐的种类、浓度、温度和PH值。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1a. 收集转瓶培养的细胞:将浓度为5~10x108细胞/l 的培养液用1 L 的塑料瓶1 850 g 离心20 min,将细胞收入50 ml 锥形离心管中(每管收2~3 L 培养液中的细胞)。进行步骤2。
1b. 收集单层培养的细胞:单层细胞长满后去掉培养液。用PBS洗1次。将细胞刮入新鲜PBS液里,倒进锥形离心管中。进行步骤2。
3a. 转瓶培养细胞:测量压紧后细胞的体积。将细胞重悬于约5倍于其pcv的PBS液中,1 850 g 离心10 min。进行步骤4。
5. 在Dounce氏玻璃匀浆器中用B号研杵缓馒上下抽提10次以上。用台盼蓝染色排斥法在显微镜下检査细胞裂解滑况(应大于80%~90%)。
9. 25 000 g 离心30 min,测量核提取物的电导率(用上请,见步骤10)。
11. 将提取物从透析袋中移出45 000 g 离心20 min。
12. 用Bradford分析法测定上清中蛋白质的浓度。分装,浸入液氮中速冻,- 80℃保存。 收起 |
注意事项 | 所有步骤的操作均在0〜4℃进行,在冷室内操作更好。缓冲液和设备要预冷。所有离心均在4℃进行,转子要预冷。 |
其他 | 细胞核提取方法的优化:
2. 将细胞核悬液分成5等份。在冷室内不断搅拌,按如下方法在每份悬液中加入1/3体积髙盐缓冲液,在第1份中加浓度最低(0.8 mol/l)的高盐缓冲液,其余各份中依次加入KCl浓度逐渐增髙(直到1.6 mol/l)的高盐缓冲液。轻轻混合30 min。 |