杆状病毒储液制备实验——从单层培养中制备

含10％胎牛血清的昆虫细胞培养液 TNM-FH

150 mm 培养瓶27℃ 培养箱倒置显微镜带有 GH-3.7 水平转子的4℃GPR离心机带螺口盖的冻存管液氮罐500 ml 旋转细胞培养瓶多转瓶的揽拌台

1. 以 1.8×10⁷ Sf 9 细胞/瓶的密度，将细胞接种于两个 150 mm 培养瓶，在含 10％ 胎牛血清的昆虫细胞培养液 TNM-FH 中培养。27℃ 温育 1 h 使细胞贴壁。

2. 当细胞贴壁时，取适量的待接种的杆状病毒于 30 ml 新鲜的含 10％ 胎牛血清的昆虫细胞培养液 TNM-FH，使感染复数（MOI）为 0.1～1。细胞贴壁后，移去培养液，每个培养瓶中各加入 15 ml 含有病毒的培养液。

MOI 以 pfu/细胞来表示。感染给定数目细胞的病毒接种物的体积=MOI （pfu/细胞）× [细胞数/毒种储液的滴度（pfu/ml）]

3. 27℃ 温育数日。每天在倒置显微镜下观察感染迹象，如细胞病变效应（如果使用包含体阴性重组病毒），或包含体（如果使用野生型杆状病毒或包含体阳性重组病毒）。包含体具高折光性，带微黄的绿色晶体状，在光学显微镜下很容易发现。

4. 当大多数细胞含有包含体或显示出细胞病变效应时（通常在感染后 4～5 天），将培养液移入灭菌试管中，4℃，1000 g 离心 10 min， 将上清移至一新的灭菌试管。分别吸取 1 ml 上清移至几个螺口冻存管中，置于液氮罐长期保存。将剩余的病毒置暗处 4℃ 短期保存。该步骤应可得到约 40 ml （1～3）× 10⁸ pfu/ml 的病毒储液。

如果待扩增的病毒源自单个噬斑（见病毒储液滴度测定实验），将琼脂糖块置于一含 0.5 ml TNM-FH/10％ FBS 的小离心管中 4℃ 旋转过夜。再按步骤 1.1 感染 Sf 9 细胞：在 100 mm 培养皿中，用 2 × 10⁶ 细胞，27℃ 温育 1 h。加入 8 ml TNM-FH /10％ FBS 培养液，27℃ 温育 4 天。按步骤 1.4 收获病毒。噬斑法确定滴度（见病毒储液滴度测定实验）， 重复步骤 1.1～1.3，扩增病毒以获得高滴度的储液。如果昆虫细胞已适应无血清培养，病毒储液也可用无血清培养的昆虫细胞制备（见昆虫细胞保存培养实验）。用无血清培养液代替 TNM-FH/10％ FBS，按步骤 1.1～1.4 进行即可。