一、材料与设备
1. 工人合成的 DNA 寡核苷酸(带有 T7 启动子)。
2. SilenceTM siRNA Construction 试剂盒(Ambion 公司)。
3. 核酸转染试剂(如 Lipofetaminc 2000) 。
二、操作方法
1. 设计并合成两条长 29 nt 的 DNA 寡核苷酸(作为合成 siRNA 的模板),它包含一 段 21 nt 的 siRNA 序列和一段 8 nt 的与 T7 启动子(试剂盒提供)3' 端互补的序列(5'-CCT-GTCTC-3' )。
2. 用经 DEPC 处理的无菌水溶解合成的正、反义链 DNA 模板至终浓度为 100 μmol/L 首先将合成的两条 siRNA 分子模板分别与 T7 启动子引物杂交。反应体系如下:T7 启动子引物 2 μl,DNA 杂交缓冲液 6 μl,siRNA 分子单链 DNA 模板 2 μl,总体积 10 μI。 将混合液于 70℃ 变性 5 min,然后冷却至室温并放置 5 min。
3. 然后采用 DNA 聚合酶 ⅠKlenow 大片段进行延伸,产生双链的 siRNA 分子转录模板。反应体系如下:DNA 模板混合液 10 μl,10X KIenow 反应缓冲液 2 μl,10X dNTP 混合液 2 μl,无核酸酶水 4 μl,Exo-Klenow 2 μl,总体积 20 μl。 轻轻混匀后置于 37℃ 反应 30 min。
4. 对于每个 siRNA 分子应该进行两次体外转录反应以分别合成 siRNA 分子的正义与反义链。每个转录反应都要按照如下的顺序加入相应的成分:正义或反义 siRNA 链模板(步骤(3) 的反应产物)2 μl,无核酸酶水 4 μl,2X NTP 混合物 10 μl,10X T7 反应缓冲液 2 μl,T7 RNA 聚合酶 2 μl,总体积 20 μl。
将上述组分轻轻混匀后置于 37℃ 反应 2 h,然后将正义与反义 RNA 转录产物混合,置 37°C 水浴过夜(>16 h) ,使正义与反义RNA 单链分子退火形成双链的 siRNA 分子。
5. 在转录产物中加入 DNase 和单链特异性的 RNase T1,37℃ 处理 2 h,以去除 DNA 模板、siRNA 引导序列以及未杂交的 RNA 分子,然后加入 400 μl 的 siRNA 结合缓冲液并置于室温 2~5 min。
6. 在含有滤膜的 siRNA 分子制备离心柱中加入 100 μl siRNA 漂洗缓冲液(wash buffer ), 再加入步骤 (5) 获得的 siRNA 溶液,室温 10000 r/min 离心 1 min,弃洗液并用 500 μl 漂洗缓冲液重复洗离心柱一次。
7. 将离心柱置于一个干净的 1.5 ml Eppendoff 离心管中,在离心柱中加入预热到 75℃ 的无核酸酶的水,并置于室温 2 min,然后室温 12000 r/min,离心 2 min,洗脱液即为纯化的 siRNA 分子。用紫外分光光度计确定所制备的 siRNA 溶液的浓度。
8. 取制备好的 siRNA 分子在 Lipoktaminc 2000 介导下转染细胞,或置 -70°C 保存备用。 |