实验方法原理 | 葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力,并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类,可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 用0.1 M PH8.0 磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶,15 min。按1 g干胶200 ml上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤) 2. 装柱后用0.1 M PH8.0磷酸缓冲液平衡
3. 标本可用硫酸铵粗提物,先10000 g离心除去杂质,必要时用0.22 μm滤膜过滤。上样前用1 M PH9.0 Tris液调整标本液PH至8.1或对平衡液透析过夜
4. 加样,一般按25~30 mgIgG/g湿胶比例加样,室温作用15 min,0.1 M PH8.0磷酸缓冲液充分淋洗至淋洗液OD值为<0.02 5. 用不同PH的枸椽酸洗脱液洗脱,流速20 ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用PH6.0;纯化IgG2a用PH4.0;纯化IgG2b用0.1 M PH3.0醋酸盐缓冲液或0.1 M PH3.0 Glycine-HCl缓冲液洗脱
6. 用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时,用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液
7. 收集洗脱液测OD值,根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定 展开 |
注意事项 | 1. SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵,可再生后反复使用10~20次左右。 2. SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法还可用于 3. 狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。 展开 |