常规聚丙烯酰胺凝胶电泳实验——样品的准备

一、选择合适的样品缓冲液

常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品不需作特殊处理。最重要的是选择合适的 pH 和离子强度的缓冲液作为样品缓冲液，以保证样品的溶解性、稳定性和生物活性，通常使用与缓冲系统相同的 pH, 但离子强度只为其十分之一。如样品需要特殊的稳定剂，保护剂等，应视其是否影响电泳。

为了观察电泳前沿，在样品缓冲液中应加有色指示剂，阳极电泳通常用溴酚蓝，阴极电泳通常用焦宁（pyronine)。

如是粉末样品，用样品缓冲液溶解成合适浓度。如果是带有高盐浓度的溶液样品，应先用透析方法或用 Sephadex G-25 的凝胶过滤柱脱盐，再用低离子强度的样品缓冲液平衡，使终离子强度符合样品缓冲液的要求。

如样品溶解不佳，可用尿素或非离子去污剂如 TritonX-100，NP-40 来助溶。配制好的样品最好在 10000 万转左右的台式离心机上离心 3~5 分钟，取上清加样，以免电泳时产生拖尾。

二、蛋白标准的准备

如果需要测定分子质量，则必须准备蛋白标准样品。现在市售的蛋白标准大多是由一系列纯化的，不同分子质量的蛋白质组成，它们之间不会发生相互作用，且有良好的线性关系。如安玛西亚公司的蛋白标准，分子质量范围为 66 000~669 000 Da，由 5 种蛋白组成。



蛋白标准也可自己配制，选择 5~7 种合适分子质量范围的蛋白溶解在样品缓冲液中，分装后，在 -20℃ 保存。注意不要错用 SDS 蛋白标准。

三、样品浓度

样品的浓度取决于样品的组成，分析目的和检测方法。对未知样品可作一个 0.1~20 mg/ml 蛋白的稀释系列，以寻找最佳加样浓度。如用考马斯亮蓝染色，可用浓度为 1~2 mg/ml 的样品。如果样品组分复杂，如细胞匀浆液，为了观察痕量成分，主带便会过量。对高纯度样品，0.5~2 mg/ml 蛋白为最佳。银染色所用的样品浓度可比考马斯亮蓝染色低 20~100 倍。用同工酶染色，免疫固定染色视方法不同而异。电泳后欲进行转移，应有足够的样品量。

四、加样要求

如进行垂直电泳，加样前轻轻将梳子倾斜拔出，防止气泡陷入。用电极缓冲液淋洗加样孔，吸出，再加适量电极缓冲液。然后用微量注射器小心将样品加成一细窄带（特别是连续电泳)，否则将影响电泳分辨率。如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近带的扩展。

如进行水平电泳，可以在胶面上直接加样，或用滤纸块加样，或在加样孔中加样。在凝胶面上直接加样时不可超过 3 μl。加样间距大于 1 cm 才可加 5 μl。对连续电泳，一定要加成一条细窄带，否则会影响分辨率。对不连续电泳，由于浓缩胶的作用，在进入分离胶以前会浓缩成细窄带。阳极电泳的样品加在阴极侧，阴极电泳的样品加在阳极侧。