核酸亲和层析法纯化蛋白质实验2

平衡缓冲液（Tris-HClKClEDTA）非特异 DNA

在上样品液到核酸亲和柱之前，建议首先采用其他的纯化方法，如硫酸铵沉淀、离子交换或凝胶过滤层析等富集目的蛋白。这样可以除去绝大多数的污染物，并减少非特异结合。亲和层析柱一般来讲是短而粗的，例如长宽比为 2：1。

1. 10 倍柱体积的平衡缓冲液（20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，0.15 mol/L KCl，1 mol/L EDTA）平衡柱；

2. 调整样品液到相似的离子浓度（即 0.15 mol/L KCl）；

3. 加非特异 DNA 到样品液内，每 ug 纯蛋白质加 100 ng。混匀后在冰上孵育 10 min。非特异 DNA 长度通常是 1 kb 左右，可以是 poly（dI-dC）或 poly（dA-dT），也可以是超声破碎的大肠杆菌、牛胸腺或鲑鱼精 DNA。为了除去孵育后可能形成的复合物，需 10 000×g 离心 10 min 弃去沉淀；

4. 缓慢地将样品液上样到亲和柱，流速 15 ml/h；

5. 5 倍体积平衡缓冲液洗柱；

6. 分别用 1 倍体积各含 0.2、0.3、0.6 和 1.0 mol/L KCl 的平衡缓冲液洗脱目的蛋白；

7. 检测各收集组分的活性，并汇集有特异活性的组分。因为蛋白质浓度时常较低，故常加入非离子型去垢剂 Triton X-100（终浓度 0.05％）以减少容器壁对蛋白质的吸附。需要注意的是该去垢剂会干扰 A₂₈₀ 测定；

8. 在 -70℃ 储存活性目的蛋白组分；

9. 用 10 倍体积的含 2.5 mol/L NaCl 和 0.5 mol/L EDTA 的平衡缓冲液洗柱使亲和柱再生。然后用含 0.02％ NaN₃ 的平衡缓冲液再平衡后将柱 4℃ 储存。