方案11 标记蛋白并通过阵列检测探究蛋白质间相互作用

单功能活性染料Cy-3或Cy-5磷酸盐缓冲溶液含有 500mmol L甘氨酸的 PBSPBST标记缓冲液

亲和层析设备离心机透析设备荧光片扫描仪保湿器孵育箱特定规格的层析设备玻片转子

一、蛋白标记

1.将染料溶人 250ul 水中，每 10ug 待标记蛋白中，加入 5ul 的染料溶液。蛋白质浓度不能低于 100 ug/ml。

在这样的条件下，蛋白质被标记的程度与蛋白质浓度无密切关系。虽然制造商推荐标记时的 pH 值为 9.3，但一般都在 pH 值为 7.5 的 PBS 缓冲液中进行标记。低 pH 有利于染料和蛋白质的氨基末端相连，而高 pH 值则导致染料与赖氨酸残基发生非选择性的掺人。

2.将染料和蛋白质的混合液在室温条件下孵育 30 min，使染料和蛋白质分子充分反应。

3.加入 0.1 倍体积含有 500rnmol/L 甘氨酸（pH8.0) 的 PBS 终止反应，在室温条件下再游育反应管 30 min。

4.用层析法或透析法除去未掺入蛋白中的染料。

若蛋白带有亲和标记（如 His6-标记或 GST-标记），用亲和层析方法，可以很方便地除去未发生掺人的染料。

二、用探针标记阵列

5.将探针缓冲液和被荧光标记的蛋白质混合后，制成探针溶液。

探针缓冲液的组分决定于被标记的蛋白质。通常缓冲液中应含有盐、去污剂和 BSA。以尽可能地避免非特异性反应的发生。另外，缓冲液中应含有还原剂、金属离子或所需的其他因子。一开始，建议使用含有 0.1% Tween-20(体积分数）和 0.O1mg/ml BSA 的 PBS(pH7.5)。被标记蛋白的最佳浓度，因不同的实验而各不相同。开始时可先采用 1ug/ml，这对约 50kDa 的蛋白质来说相当于 20nmol/L。

所用缓冲液的体积由具体实验而定。蛋白质浓度范围可从 1nmol/L~1umol/L。

6.用带有荧光标记的蛋白质作为探针标记蛋白阵列。

单阵列玻片操作方法

（1）将 CoverWell 玻片孵育箱放在桌子上，有衬垫的一面朝上。

（2）加入 550^1 探针标记溶液。

（3）将微阵列玻片慢慢沉下，置于 CoverWell 上方，带有阵列的一面朝下。

（4）插入玻片并轻轻压好玻片，注意要让 CoverWell 牢牢地封住玻片。

若操作正确得当，溶液会漫过玻片表面，且不会产生气泡。

多阵列玻片操作方法

（1）对每个阵列来说，在玻片正确的一面，加上 10?30 沁的标记蛋白。不要用盖玻片或 CoverWell 覆盖阵列。

（2）将玻片放入一个保湿器中。

7.在室温条件下，孵育玻片 lh。

8.用 PBST 将玻片轻微冲洗后，再用 PBST 把玻片冲洗 3 遍，每次 2~3 min。

9.用 PBS(没有 Tween-20 的）将玻片轻微冲洗后，用一配置有可放置玻片转子的离心机，在 200 g 条件下离心 30s，以去除残留的缓冲液。

若没有合适的转子配置，也可以采用通氮气流的方法来干燥玻片。

10.用荧光玻片扫描仪检测玻片的成像（参见「10.8.4 阅读和解析蛋白质陈列）。