实验方法原理 | Lowry 法又称为 Folin-酚试剂法。首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物,然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂 (Folin-酚上级),产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色,这种深蓝色 的复合物在745~750 nm 处有最大的吸收峰,颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比,可根据 750nm 的光吸收值大小计算蛋白质的含量。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 溶液 1.1 溶液 A,100 ml 0.5 g CUSO4·5H2O 1 g Na3C6H5O7(·2H2O) 加双蒸水至 100 ml, 溶液可长期保存于室温。 1.2 溶液 B,1L 20 g Na2CO3 4 g NaOH 加双蒸水至 1 L, 溶液可长期保存于室温。 1.3 溶液 C,51 ml Folin 溶液A 50 ml 溶液B 1.4 溶液 D,20 ml 10 ml Folin-酚试剂 10 ml 双蒸水 2. 检测 2.1 用双蒸水稀释样品至 0.5 ml; 2.2 加 2.5 ml 溶液 C; 2.3 混匀在室温下放置 5~10 min; 2.4 加 0.25 ml 溶液 D, 混匀; 2.5 20~30 min 后,在分光光度计上测 A750 值。 3. 从干扰物质中纯化蛋白质样品的附加步骤 脱氧胆酸-三氯醋酸(DOC-TCA)沉淀法。此法可在测定蛋白质的溶液浓度低于 1 ug/ml 情况下使用。 所需试剂:0.15 % (w/V)DOC:72 % TCA 3.1 于 1 ml 蛋白质样品中加入 0.1ml 0.15 % DOC; 3.2 震荡后在室温放置 10 min; 3.3 加入 0.1 ml 72 % TCA, 摇匀后,1000~3000×g 离心 5~30 min。如使用固定角转头,以及低温或大体积则需较长时间离心; 3.4 倾斜,吸弃上清液; 3.5 直接用溶液 C 溶解沉淀。 |
注意事项 | 1. 在加入试剂 20~30 min 后呈色达到饱和,此后每小时颜色信号减弱 1 %。 2. 许多干扰物质降低颜色反应,而去垢剂引起颜色轻微升高。 3. 高浓度盐可引起沉淀。 4. 氯仿抽提可去除溶液中的脂质,在 K+ 或 Triton X-100 存在时可通过离心去除混浊物。 |