氨基酸代谢标记实验_备择方案 2　示踪标记细胞

PBS(冷冻)37℃ 示踪培养基

配有液体同位素垃圾阀门的真空吸气器

1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 10⁷ ~2 × 10⁷ 细胞， 每 0 .5 × 10⁷ ~2 × 10⁷ 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [³⁵S] 甲硫氨酸脉冲标记 10~30 min （见基本方案步骤 1~4，或见备择方案 1 步骤 1~5）。

2. 去除 [³⁵S] 甲硫氨酸的工作溶液，用 10 ml 37℃ 的示踪培养基洗一次，并加入 10 ml 37℃ 的示踪培养基。

3. 37℃ 培养到预期时间。拧紧试管盖子在旋转情况下培养细胞悬液。在 032 培养箱里孵育贴壁细胞。

4. 刮取贴壁细胞并转移到 15 ml 离心管。收集刮取的细胞或细胞悬浮液于 4℃ 300 g 离心 5 min。

5. 可选：通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量（见辅助方案）。

1. 将2倍体积含有过量未标记甲硫氨酸（15mg/L）的示踪培养基直接加入到标记混合物中，能够快速终止标记反应。

2. 示踪≤2 h，细胞悬液的最终浓度应该是 2 × 10⁶ 细胞/ml，或示踪>2 h，用 0.5 × 10⁶ 细胞/ml。 对贴壁细胞而言，加 10 ml/100 mm 平皿。

1. 上清可以弃掉，也可以收集起来用于分析分泌或脱落到培养基中的蛋白质。

2. 如果细胞沉淀不马上使用的话，见基本方案步骤7。