实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 按正确读框将DNA片段亚克隆入合适的pGEX载体中,转化大肠杆菌感受态细胞, 在LB/氨苄青霉素平皿上筛选转化子,以不插入外源DNA的自连载体作对照,平皿置37℃孵育12~15 h。
2. 挑取转化菌落接种于2 ml LB/氨苄青霉素培养基,并在氨苄青霉素主平板上划线培养。同时接种含母本pGEX载体的转化菌作对照。将主平板于37℃下温育12~15 h。液体培养物则于37℃摇床中振荡培养,直至混浊。
4. 将液体培养物移入一个作好标记的微量离心管中,室温下以最高速度离心5 s,弃上清,沉淀用300 μl 冰浴预冷的PBS液重悬。取10 μl 入另一个作好标记的离心管中 。
5. 用带直径2 mm 探头的超声波发生器破碎细胞,4℃下高速离心5 min,除去不溶性物质, 将上清移入一新的离心管中。
6. 毎管上清加50 μl 50%谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液,室温下轻柔混匀,加1 ml PBS用旋涡混合器短暂振荡旋起,高速离心5 s,收集琼脂糖珠,弃去上清,重复用PBS洗涤2次。
7. 往冼过的琼脂糖珠中加等体积的1×SDS样品缓冲液,另加入30 μl 于10 μl 的全细胞 重悬液中,100℃加热3 min,用旋涡混合器短暂振荡旋起后,加样于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上,电泳适当时间,用考马斯亮蓝染色使GST蛋白和融合蛋白显迹。
9. 以1:10比例将此培养物稀释于1 L 新鲜的LB/氨苄青霉素培养基中,分入两个2 L 的瓶中,37℃下培养1 h。
12. 将离心管置于冰浴,用带直径5 mm 探头的超声波发生器裂解细胞,调整频率和强度避免产生泡沫,伹使裂解于30 s 内完成。
15. 室温下500 g 离心10 s,收集琼脂糖珠,弃上清。加1 ml 50 mmol/l Tris·Cl(pH8.0)/5 mmol/l 还原型谷胱甘肽冼脱融合蛋白。轻柔混匀2 min,500 g 离心10 s,收集上清, 重复冼脱2~3次,经SDS-PAGE分析各分部收集的样品。洗脱的蛋白质分成小份,加甘油10%贮存于-70℃。测量280 nm 下的吸光度确定融合蛋白产量,对GST载体来说,A280=1相当于蛋白质浓度为0.5 mg/ml。 展开 |