1. 消化
取健康待克隆细胞,吸出瓶内培养液,加消化液; 2. 低密度细胞悬液的制备
做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液:然后稀释细胞,使之成为1~2 细胞/毫升悬液;最适宜细胞密度为1~2 细胞/ml 培养液;
3. 接种
先用吸管轻轻吹打细胞悬液,使混悬均匀,继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5 毫升;接种时要迅速准确,争取在最短时间内加完,以免培养液蒸发,然后迅速盖好盖板,置CO2温箱培养;
4. 标记
培养过6~12 小时后,待细胞下沉并贴附于培养板孔底后,从温中取出,置倒置光显微镜台上,观察和标记下含单个细胞的孔,置CO2温箱培养;CO2箱内含有水槽,以保持箱内湿度。
在培养中一般无需换液,只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基,但不要吸除过多,余少许,以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液,继续培养3~4 周。待孔内细胞增至500~600 个时,可进行分离培养;
5. 分离扩大培养
培养86~96 小进后进行观察。
挑选生长良好的单细胞克隆孔,先吸除旧培养液,用Hanks洗1~2 次,继加胰蛋白酶少许,加入量以能覆盖细胞群即可,如过多,应吸除多余消化液。
置于倒置显微镜下窥视,待发现细胞变圆时,加入0.1 ml 含10 %血清地克隆培养基,用吸管轻轻吹打,当细胞离开底物悬浮后,一并吸入管内,移入另瓶或皿中,再补加一定量克隆培养液,置CO2温箱中继续培养、增量,使之形成新的细胞群体后,即转用常规培养法培养。
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