人肿瘤抗原可以:(1)用于肿瘤诊断;(2)免疫治疗。
实验方法原理 |
本实验用Dynabeads protein A 进行免疫复合物的纯化。Dynabeads A 蛋白 (Dynabeads Protein A) 在免疫沉淀中有以下作用: (1)将方案时间减少到 30 分钟。 (2)显著降低非特异性结合造成的背景 (3)保持蛋白质复合物的完整。对珍贵的蛋白质没有物理压力。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、 裂解细胞
二、裂解物的预处理
2. 将Dynabeads protein A 振荡混匀,吸取100 ul 磁珠于EP 管中,置于磁铁架(Dynal MPC)上,磁珠吸附到管壁上,弃上清。
3. 加500 ul 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管,轻柔搓动管子约2~3 min,将EP管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清。
4. 重复2 步骤两次。
5. 清洗完磁珠后,加500 ul 预处理后的裂解物,反复摇动管子,室温下反应10~20 min。
6. 将EP管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,将上清转移至另一EP管中。
7. 用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次。
8. 洗脱抗原-抗体复合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 ul于Ep 管中,轻柔搓动管子约2~3 min,将P管置于磁铁架上,吸取上清于一EP管。
9. 重复步骤7,将上清收集于同一个EP管洗脱样品总体积为60 ul,作对照用。
10. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后备用。
11. 在步骤5 留取的上清中加入病人血清(1 ml 加2 ul 血清),缓慢摇动,室温孵育2~3 h。
12. 将EP管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清。
13. 重复步骤6~8。共收集到两份样品,对照与病人的纯化免疫复合物各60 ul。
14. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱储液100 ul,40℃ 保存。
15. 在样品中加入2xSDS 上样缓冲液并用1 M NaOH 调节pH 至使溴酚蓝呈蓝色。
四、结果分析 150 mmol/L NaCl;1.0%NP-40;0.5%脱氧胆酸钠; 0.1%SDS ;50 mmol/L Tris( pH8.0)。 展开 |
注意事项 | 为了避免抗体的共洗脱,在继续进行免疫沉淀之前,应该将抗体交联到免疫磁珠,建议使用交联剂。 |
其他 | Dynabeads protein A 捕获的 Ig 量取决于起始样品中 Ig 的浓度。 100 µl Dynabeads A 蛋白可从含有 20- 200 µg IgG ⁄ml 的样品中分离约 25- 30 µg 人 IgG。 绝大部分位点与 Fc 结合,实现最优的 Ig 取向。 |