单克隆抗体的纯化可用于:(1)制备体外诊断试剂;(2)制备治疗用药
实验方法原理 | 目前常用的纯化方法有:盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等方法达到纯化目的,也有采用较简便的酸沉淀法。最有效的纯化法为亲合纯化法,常用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联,制备亲合层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可超过90%。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | 蛋白 A-琼脂糖 CL-4BTr1s 缓冲液 pH 8.6柠檬酸盐缓冲液 pH 5.5乙酸盐缓冲液 PH 4.3甘氨酸•Cl 缓冲液 pH 2.3中和缓冲液 pH 7.7 |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1)将蛋白 A-琼脂糖置于 50 倍体积的 Tris 缓冲液中充分溶胀。在室温下将其灌入直径为 2.5 cm 玻璃层析柱中,用 Tris 缓冲液平衡。 10-20 mL 腹水中的抗体,可用干重大约为 3 g 的蛋白 A-琼脂糖纯化。 2)腹水液稀释于 3 倍体积的 Tris 缓冲液,以 1-5 mL/min 的速度上样于蛋白 A-琼脂糖柱,用 Tris 缓冲液洗柱子直至所有的未结合的蛋白质都被洗脱,采用 A280 监测流出液。 3)依次用 2-3 倍柱床体积的柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液以及甘氨酸•Cl 缓冲液连续洗脱结合蛋白质,洗脱液直接接入装有中和缓冲液的管中。中和缓冲液的体积应为所收集液体积的 1/4。 4)采用 ELISA 法检测洗脱液的抗原特异性 MAb。 5)在超滤器中浓缩所分离的单克隆抗体到 1-5 mg/mL,所用超滤膜为 ×M50。将单克 隆抗体储存于-20℃。测定 A280。以计算抗体浓度,鼠的 IgG 溶液 1 mg/mL=1. 44 吸光度单位。 展开 |
注意事项 | 另一种缓冲液系统(由 Amersham Pharmac1a B1otech 建议的)对于某些单克隆抗体具有更高的结合能力。这些备择的缓冲液如下所示: 甘氨酸-OH 缓冲液(替换 Tris 缓冲液) 0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 6.0 及 pH 5.0 (替换柠檬酸盐缓冲液) 0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 4.0 (替换乙酸盐缓冲液) 0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 3.2 (替换甘氨酸•Cl 缓冲液) 展开 |
其他 | 来源:《精编分子生物学实验指南》第五版 |