实验步骤 |
在 筛 选 检 测(辅助方案 1 ) 方案完善之前不应进行细胞融合。由于在细胞融合后可对目标单克隆抗体进行检测的次数是有限的,在细胞融合前必须检查条件培养液以排除筛选时可能出现的人为因素影响。 材 料SP2/0-Agl4 骨 髓 瘤 细 胞 系(药物标记的非分泌型; ATCC) 添加10 mmol/L HEPES 和 lmmol/L丙酮酸钠的 DMEM-10和 DMEM-20 完全培养基(附 录 1) 免疫的实验动物:小鼠、大 鼠 或 仓 鼠(在 初 次 接 种 后 10〜14d 备 用 ,见基本方案1) 5 0 % (m/V) PEG 溶液,无菌 DMEM完全培养基,未添加血清 氯化铵溶液:〇. 〇 2mol/L T ris. Cl, pH7.2(附录 I)/O .14mol/L NH4C1 添加 10 mmol/L HEPES、 lmmol/L 丙酮酸钠、 I X HAT 或 I X HT 的 DMEM-20完全培养基,取 自 IOOX包 装(以 Sigma公司产品为例),储 存 于 4°C一个月7 0 % (V A O 乙醇,仅用于容器消毒 175 cm2 组织培养用细颈瓶 倒置显微镜 400 ml和 600 ml烧 杯(各 3 只) IOOmm有盖培养皿 尖头镊和解剖剪 细网金属筛 50 ml塑料锥底离心管,无菌 Beckman离心机和TH-4转子或同等设备 9 6 孔平底微量滴定板 Im l和 IOml 移液管 1.细胞融合前一周,幵 始 在 添 加 HEPES 和 丙 酮 酸 钠 的 DMEM-10 完全培养基中培养SP2/0-Ag1 4 骨 髓 瘤 细 胞 系(融合用细胞)。在细胞融合操作前骨髓瘤细胞对于不同的实验动物应达到以下水平(每 个 175 cm2 培 养 瓶 含 培 养 液IOOml) : 小 鼠 , IXlO8个细胞/瓶 , 2 或 3 瓶 ;仓鼠, 2 X 108 个细胞/瓶 , 3 或 4 瓶 ;大 鼠 , 5 X 108〜IXlO9个细胞/瓶 , 1 0 瓶 。 2.细胞融合前3d,进 行 二 次 免 疫(见基本方案 1 ,步 骤 7)。 3 . 细胞融合前ld, 转 移 SP2/0-Ag1 4 骨髓瘤细胞至新鲜的添加 HEPES 和丙酮酸钠的 5.将以下物品于37°C预热: 20 ml 无菌的未加血清的DMEM完全培养液; 5 ml无 菌 的 5 0 % PEG溶液。 6.处死二次免疫的实验动物(附 录 2 G)。不要用麻醉法处死动物。对 于 小 鼠 ,应用颈椎脱臼法,对于大鼠和仓鼠应用二氧化碳窒息法,取 脾 脏(附 录 2 H)。 7.将脾脏移至预置了 IOml无菌的未加血清的DMEM完 全 培 养 液 的IOOmm培养皿中。以下操作要求在层流罩中超净工作台完成。 8.使用尖头镊压碾或解剖剪将脾组织剪碎,移去组织碎片并通过细网金属筛进一步分离细胞,制成单细胞悬液。 9.将脾细胞悬液移至已消毒的50 ml塑料锥底离心管,并 用 无 血 清DMEM完全培养液加 满 离 心 管(不要使用含有蛋白质或HEPES 的培养液)。室温下, TH-4离心机中500 g 离 心 5 min, 弃上清。 10.在 5 ml氯化铵溶液中将细胞沉淀重悬以裂解红细胞。在 室 温 下 静 置 5mirx,加入45 ml无 血 清 DMEM完全培养液,如 步 骤 9 进行离心。 11.加 入 50m l无 血 清 DMEM完 全 培 养 液 ,将 沉 淀 重 悬 ,并 再 次 离 心 。重复添加DMEM和 离 心 1 次 ,以完成2 次洗涤。 12.在洗涤脾细胞的同时,将 SP2/0-Agl4 骨 髓 瘤 细 胞 移 入 50 ml塑料锥底离心管。如步 骤 9 进行离心,分离细胞。在 DMEM中重悬细胞,如 步 骤 1 1 洗涤骨髓瘤细胞3 次 。 13.分 别 在 IOml无血 清DMEM完全培养液中重悬脾细胞和骨髓瘤细胞。用细胞计数器和台盼蓝拒染试验对两种细胞悬液进行细胞计数和活力测定(附 录 3 0 。此时两种细胞悬液应该都具有1 0 0 % 的细胞活力。 14.在 细 胞 计 数 的 基 础 上 ,以 约 2. 5 X IO6 个 总 细 胞 数 /m l计 算 培 养 细 胞 所 需 添 加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20 培养基的量。 37°C水浴预热此培养基。取 9 6 孔平底微量滴定板做好标签备用,每 IOml 细胞悬液需准备一个孔板。 15.将 SP2/0-Agl4 骨髓瘤细胞与脾细胞以I : I (V/V ) 的 比 例 在 50m l塑料锥底离心管中混合。以无血清DMEM完全培养液加满离心管。室温下, 500 g 离 心 5 min。 16.在进行细胞离心的同时,在 层 流 罩 中 准 备 三 个 600m l烧 杯(步 骤 5),内 盛 75〜100 ml 37°C温水,再 将 3 个 内 盛 100 ml 37°C温 水 的 400 ml烧杯分别放入600 ml烧杯中,形成水浴环境。将 预 热 的 5 0 % PEG溶液试管与无血清DMEM完全培养液试管(步 骤 5 ) 分别放入 2 个 37°C水浴中。 17.吸取并丢弃混合细胞离心的上清部分(步 骤 15),并将离心管置于第三个水浴烧杯中。使 用 Iml移液器向混合细胞沉淀中加入Iml预 热 的 5 0 % PEG,在 Imin内勻速逐滴缓慢加入,每加入一滴即用移液器轻轻搅匀细胞。滴加完成后轻轻搅匀lmin。 18.使用干净的移液管向混合细胞液中逐滴加入预热的无血清DMEM完全培养液,加入的同时轻轻搅匀: Imin内匀速滴加 Iml DMEM; Imin内匀速滴加Iml DMEM; 2〜3 min内匀速滴加7 ml DMEM (使用IOml移液管)。 注意,此时应有肉眼可见的细胞团漂浮。室温下, 500 g 离 心 5 min。 19.在进行细胞离心的同时,将水浴烧杯重新加热到37°C ,并放入层流罩。将预热的添加 HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10 完全培养基放人水浴。 20.弃 上 清(步 骤 18),将试管放入水浴。用 干 净 的IOml移液管将预热的添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10 完全培养基用力吹入细胞沉淀。连续添加,直到将所有培养基加入步骤1 4 准备的培养基。如果培养基体积超过了 50 ml,小心地吸取多余量
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