实验步骤 | 基 本 方 案 1 用 AUTOMACS 系 统 进行 总 T 细胞、 CD4 +细 胞 或 CD8+T细胞的自动分离材 料小鼠 HBSS 洗涤缓冲液 基 本 方 案 2 使 用 AUTOMACS 系 统 进 行 B 细胞的自动分选材 料小鼠 HBSS 洗涤缓冲液 MACS 缓冲液 CD45R (B2 2 0 ) 磁 珠(Miltenyi) RPMI-10 完全培养基 autoMACS 系 统 和 分 选 柱(Miltenyi) 30um 尼 龙 网(BD) 或 40/xm 预 分 离 滤 膜(Miltenyi) 1 . 用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞(单 元 2.1)。 2.将细胞在 10 ml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数(附 录 3A)。 3.将细胞悬液在 4℃, 20og离心 10min。弃上清后将沉淀按每 108 个细胞 0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每 108 个细胞加入 0.1ml CD45R(B220) 磁珠后在 4℃孵育 15 min 4.按基本方案 1 中的步骤 4〜7 操作,这样 B 细胞将从阳性通道洗脱。 基 本 方 案 3 使 用 AUTOMACS 系统进行辅助细胞的自动分选材 料 HBSS 洗涤缓冲液 MACS 缓冲液 CD90 (Thyl.2 ) 磁 珠(Miltenyi) RPMI-IO 完全培养基 autoMACS 系统和分选柱(Miltenyi) 30um 尼 龙 网(BD) 或 40um 预分离滤膜(Miltenyi) 1.用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞(单元 2.1)。 2.将细胞在 IOml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数(附录 3A)。 3.将细胞悬液在 4°C, 200 g 离心 lOmin。弃上清后将沉淀按每 IO8 个细胞 0. 9 mlMACS缓冲液的比例混悬。每 1 〇 8 个细胞加入0.1ml CD90 (Thy1.2) 磁珠后在 4℃孵育 15 min 4.除了选择 depletes 程 序(非 possel 程序),其他操作按基本方案 1 中的步骤 4〜7 进行,这样辅助细胞将从阴性通道洗脱。 备 选 方 案 1 用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞附 加 材 料(其 他 材 料 见 基 本 方 案 1 ) 不含气体的 MACS 缓冲液, 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷) Midi MACS 分离磁铁、 MACS 多用支架、 LS 或 LD 分 选 (Miltenyi) 15 ml 离心管,无菌 la. 对于分离总 T 细胞, CD4+ T 细胞或 CD8+ T 细胞:按前述方法制备并标记单细胞悬 液(见基本方案 1, 1〜3 步)。 lb. 对于分离 B 细胞:按前述方法制备并标记单细胞悬液(见基本方案 2 , 步骤 1〜3)。 lc. 对于分离辅助细胞:按前述方法制备并标记单细胞悬液(见基本方案 3 , 步骤1〜3 2.将细胞悬液在 4°C, 200 g 离心 lOmin。 3.离心期间,将 Midi MACS 分离磁铁安装到 MACS 多用支架上,并将 LS 分选柱(用于分离总 T 细胞、 CD4+T 细胞、 CD8+T 细胞或 B 细胞)或 LD 柱(用于分离辅助细胞)放到磁体中,在分选柱下放一支无菌的 15 ml 离心管。用 4°C 不含气体的 MACS缓冲液冲洗分选柱 3 次,每次 3 ml。弃洗脱液,在分选柱下方放置一支干净的无菌离心管。 基 本 方 案 4 用 AUTOMACS 系统自动 分 选 CD4 +CD2 5+ 抑制性细胞由此方法得到的阴性细胞(CD4+CD2 5- ) 可用作反应细胞或对照细胞。 备 选 方 案 2 用磁性分选柱手工操作分离 CD4 +CD25+抑制性细胞附 加 材 料(其 他 材 料 见 基 本 方 案 4) Midi MACS 分 离 磁 铁(Miltenyi) MACS 多 用 支 架(Miltenyi) LD 分 选 柱(Miltenyi) |
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