实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 贴壁培养细胞倾去培养液,加 PBS 洗 2次,加胰蛋白酶消化 (37℃, 5~10 min)后移入Ep管中,2000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 PBS 悬浮细胞,离心洗涤 2~3次,用 PBS 重新悬浮细胞, 3500 r/min, 弃上清液。 2. 悬浮细胞的培养 移入 Ep 管中,以 2000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 PBS 悬浮细胞,余下的操作同贴壁培养细胞。 3. 加人 1/2 体积 2M NaCl 和 1/2 体积 20% PEG 6000( 聚乙二醇 6000), 充分混匀溶解,置于 4℃ 8~12 h 或过夜, 3500 r/min 离心 20 min, 弃上清液。 4. 加 1/10 原培养液体积的裂解液,混匀, 37℃作用 2~3 h 。 5. 用等体积的平衡酚抽提 1次,再用氯仿/异戊醇 (24:1)抽提 3~4次。 6. 加入 1/10 体积 2.5mmol/L NaAc pH 和 2倍体积无水乙醇,置- 20℃过夜。 15000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 70% 乙醇洗 1次,倒置离心管自然干燥或真空抽干。 7. 加适量 TE 缓冲液溶解沉淀,做 DNA 模板。获得病毒DNA。 展开 |
注意事项 | |
其他 | 1. 裂解液由 0.5%SDS 、10mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)、5 mmol/L EDTA 、10 µg/ml RNase和 50µg/ml 蛋白酶 K 组成。 2. TE 缓冲液由 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8) 和 10 mmol/L EDTA 组成。 |