实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 接种2.5x108 Sf9细胞于含5 ml 完全培养液/10%胎牛血清的25 cm2 培养瓶中,27℃温育≥2 h。从含无血清完全培养液和重组蚀斑的1 ml 病毒贮液中取0.5 ml 分别加入各个培养瓶。4℃保存剩余的0.5 ml 重组病毒,待以后用于蚀斑试验。
3. 于4℃1 000 g 离心10 min,将含有扩增病毒的上清转移至一支无菌15 ml 聚丙烯离心管中。
4. 接种2.5x106 Sf9细胞于含5 ml 完全培养液/10%胎牛血清的25 cm2 培养瓶中。为每 ―待测病毒贮液准备一个培养瓶,另准备一个作为非感染对照。27℃温育≥2 h,使细胞贴壁。弃去细胞培养液并向培养瓶中加入1.5 ml 扩增的病毒贮液,27℃温育2天。
6. 于4℃,1 000 g 离心10 min,如果目的蛋白是分泌型蛋白质,将培养上清移至一新管, 进行步骤8。如果待研究蛋白是胞内蛋白,则弃上清,用PBS轻轻将细胞团块重悬洗涤,重复离心并弃上清。
(1)免疫印迹:在单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上,每一泳道加入20~40 ug 细胞总蛋白。记住要包括非感染对照。
10. 解释结果,以鉴定出哪一个假定的重组蚀斑是产生所需蛋白的重组子,将其进行蚀斑纯化,以使其免受任何野生型病毒污染。制备大量病毒毒种贮 液,并测定重组病毒的滴度。 展开 |