实验仪器:电泳仪 电泳槽 血清加样带 分光光度计 滤纸 剪刀
实验材料:醋酸纤维素膜 规格2×8cm。
实验试剂:
l. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(PH8.6+ 0.1. 离子强度0.06):称取巴比妥2.21g,巴比妥钠12.369于500ml蒸馏水中,加热溶解,待冷至室温后,再用蒸馏水补充至于1L。
2. 氨基黑 10B染色液:称取氨基10B 0.1g,溶于无水乙醇20ml中,使溶解。另取磺基水杨酸2.5g,溶于74.5ml蒸馏水中,再将二液混合摇匀。
3. 漂洗液:甲醇45ml,冰醋酸5ml和蒸馏水50ml,摇匀.
4. 0.4 M 氢氧化钠溶液。
实验操作:
1. 将缓冲液加入电泳槽内,调节两侧槽内的缓冲液,使其在同一水平面上。
2. 醋纤膜的准备:取在缓冲液中浸泡的醋纤膜一张,在毛面的一端(负极侧)1.5厘米处,用铅笔画一横线,作点样标记,编号后,将醋纤膜置于巴比妥-巴比妥钠缓冲液中浸泡,待充分浸透后取出(一般为二十分钟)夹于洁净滤纸中间,吸去多余的缓冲液。
3. 将醋纤膜毛面向上贴于电泳槽的支架上拉直,用微量吸管吸取无溶血血清在横线处沿横线加3-5微升。样品应与膜的边缘保持一定距离,以免电泳图谱中蛋白区带变形,待血清渗入膜后,反转醋纤膜,使光面上平直地贴于电泳槽的支架上,用双层滤纸或四层纱布将膜的两端与缓冲液连通,稍待片刻.
4. 接通电源,注意醋纤膜上的正负极,切勿接错.电压90-150伏,电流0.4-0.6mA/cm宽(不同电泳仪所需电压. 电流可能不同,应灵活掌握);夏季通电45分钟,冬季通电60分钟,待电泳区带展开约25-35mm。,即可关闭电源。
5. 染色:通电完毕,取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中,染色5-10分钟(以白蛋白染透为止),然后在漂洗液中漂去剩余染料,直至背景无色为止。
6. 定量:将漂洗净的薄膜吸干,剪下各染色的蛋白区带放入相应的试管内,在白蛋白管内加 0.4M氢氧化钠溶液6ml(计算时吸光度乘2),其余各加3ml,振摇数次,置37度水箱20分钟,使其染料浸出. 对于浸出的氨基黑10B,用分光光度计,在波长600-620nm读取各管吸光度,然后计算各自的含量(在醋纤膜的无蛋白区带部分,剪一条与白蛋白区带同宽度的膜条,作为空白对照).
计算:
各组分蛋白%=Ax/At×100%
各组分蛋白g/L=各组分蛋白百分数×血清总蛋白g/L
AX表各组分蛋白吸光度At表各组分蛋白吸光度总和
参考值:
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