实验概要
本实验介绍了植物组织mRNA的提取方法。
实验原理
由于mRNA末端含有多poly(A) ,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。
主要试剂
1. 0.1mol/L NaOH
2. 3M NaAc(pH5.2)
3. 70%乙醇
主要设备
1. 巴斯德吸管
2. 高压灭菌锅
3. 65℃水浴锅
4. 高速离心机
实验材料
提取的RNA液。
实验步骤
1. 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2. 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3. 用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。
4. 将提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5. 测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6. 测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。
7. 加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
8. 4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
9. 小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。
10. 用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。
注意事项
1. mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2. oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。