实验概要
本实验介绍了人癌细胞染色体制备的基本原理及操作步骤。有助于学习人类染色体制备的常规方法,了解人癌细胞染色体及其变异。
实验原理
目前大多数癌症都建立了相应的细胞株或细胞系,体外培养的癌细胞多属于连续的周期细胞,可以用来制备染色体。国内外制备动物和人类染色体的常规方法是空气干燥法,该方法的关键包括:
1. 秋水仙素的预处理:秋水仙素又叫秋水仙碱,它是从植物中提取的一种生物碱,秋水仙素对细胞的作用主要有两个方面,一是阻挠微管的聚合、破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂,从而积累大量中期分裂相;二是使染色体收缩成一定的形状。
2. 低渗:用渗透压很低的盐溶液或蒸馏水处理活细胞,使细胞胀大而不破裂,使最后制成的片子染色体充分散开。
3. 滴片、干燥:相对于过去制备染色体的切片法和压片法的一种方法,首先制备细胞悬液,然后将悬液滴在载玻片上使细胞和染色体分散并紧贴在载玻片上,经自然风干或风机吹干,即可供染色检查。
主要试剂
1. Carnoy固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)
2. 0.1%秋水仙素溶液:取10mg秋水仙素,加入10ml0.65%生理盐水。
3. 0.075M KCl
4. Giemsa染液
Giemsa粉剂 0.5g
甘油 33ml
甲醇 33ml
先将少量甘油加入研钵中,将Giemsa粉充分研细,再倒入剩余甘油,并在56℃温箱中保温2小时,然后再加入甲醇混匀,储存在棕色瓶内。
5. pH 6.5的磷酸缓冲液。
主要设备
1. 离心机
2. 普通光学显微镜
3. 10ml离心管
4. 吸管
5. 酒精灯
6. 载玻片
7. 吸水纸
8. 擦镜纸
实验材料
Hela细胞或白血病K562细胞。
实验步骤
1. 收集生长旺盛的细胞,吹打散,加入秋水仙素使终浓度达到1ug/ml进行预处理;
2. 经预处理6-8小时后,以800rpm离心7min,去上清;
3. 加入1ml 0.075M KCl溶液,轻轻吹打,使细胞重悬,然后补加7ml KCl溶液,室温下低渗20min;
4. 加入3-4滴Carnoy固定液后800rpm离心7min,去上清;
5.沿管壁慢慢加入3ml固定液,2min后用吸管轻轻的吹打,使细胞分散,固定10min后,离心去上清;
6. 加新配的固定液3ml吹打均匀,固定10min,800rpm离心去上清;
7. 重复第六步;
8. 去上清后剩0.2-0.5ml固定液,用吸管吹打使其成为细胞悬液;
9. 吸了细胞悬液滴于冰冷的载玻片上(经80%乙醇浸泡,0-4℃冰箱冷藏),吹散,过火5s左右;
10. 风机吹干,置于装有Giemsa染液的染色缸内,染色20min,水洗后吹干,镜检。