实验概要
淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群,它们具有不同的特性和功能,为此在进行某些免疫学实验时,首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。本实验介绍了T、B淋巴细胞分离试验的操作步骤。
实验原理
本试验的原理为:淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物(简称AET)处理的绵羊红细胞(SRBC)混合后,其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC,形成牢固稳定而巨大的E—花环,较正常未处理的SRBC形成的E—花环百分比为高,而且形成快速,不易脱落,重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时,AET—E花环易沉于管底,而未形成E—花环的T淋巴细胞,用低渗液解花环周围的 AET—SRBC,便可获得纯T淋巴细胞,而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。
主要试剂
1. 溴花二氨基异硫氢化物(AET)
2. 淋巴细胞分层液
3. 其它Hanks液,含小牛血清的199培养液,无菌生理盐水,3.5%氯化钠溶液等。
主要设备
离心机,冰箱等。
实验材料
1. 新鲜豚鼠血
2. 兔红细胞(RRBC)
实验步骤
1. AET—RRBC制备
1) AET溶液的制备
称取AET粉剂402毫克,溶于10毫升蒸馏水中,使成为0.143M溶液,用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制,不宜久存。
2) AET处理RRBC
取洗涤好压积的RRBC,按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟,每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口(1—2厘米)1800转/分离心5分钟。连续洗涤3—5次,每洗一次,必须充分摇匀,以减少AET—RRBC粘附成团,并观察有无溶血。若有溶血现象,则用含小牛血清的199培养基再洗一次,最后配成10%AET—RRBC悬液,置4℃保存,不得超过5天。
3) 1%AET—RRBC的配制:
将预先配制并保存于4℃冰箱的10%浓度的AET—RRBC,以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。
2. 从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞,操作见后试验。
3. AET—E花环试验:
将分离的单个核细胞(2ⅹ106/毫升)与等量1%AET—RRBC混合,置37℃水浴15分钟,每隔5分钟摇匀一次,分装数管,每管2—3毫升,低速离心(1000转/分钟)5分钟后,移至4℃冰箱45分钟。
4. T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离
将形成E—花环的细胞悬液,再用淋巴细胞分层液分离,吸取界面云雾状的细胞,即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E—花环,用Hanks液洗一次后,加双蒸水3毫升处理3分钟,低渗裂解E—花环周围的RRBC,立即加3.5%氯化钠溶液1毫升,使还原为等渗,低速离心沉淀,即得富含T淋巴细胞群。