血细胞分离技术

实验概要

血细胞是免疫学研究或临床检验常用的检测对象或试验材料，分离和纯化血细胞是实验室中的基本技术。目前分离血细胞的技术大多是根据各种细胞群特有的大小、沉降率、粘附性和吞噬能力等设计而成。

实验原理

外周血液中的红细胞与白细胞的比例在几百甚至上千比一，两类细胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同，红细胞自然沉降率较快，加入高分子量的聚合物如明胶或右旋糖酐，还可加速其凝聚。另外，用低渗溶液处理红细胞可使之溶解。因而常用自然沉降法和密度梯度离心法分离被检血液中的淋巴细胞。

主要试剂

1. 抗凝剂1000u/ml肝素溶液(先称取每mg含100u的肝素100mg，溶于10ml 0.9%灭菌生理盐水中)，或3.8%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液。

2. Hank′s液

3. 淋巴细胞分层液所用的分层液为聚蔗糖(Ficoll)泛影葡胺(Urografin)混合液，比重为1.077~1.078；或泛影葡胺与右旋醣酐(Dextran)配成比重为1.07~1.09供用。

   9%聚蔗糖24份

   3.4%泛影葡胺10份

以上二液混合后，用G5玻璃过滤器滤过除菌，4℃冰箱保存备用。

   3.4%泛影葡胺10份

   6.0%右旋醣酐125份

以上二液混合后，分装于棕色瓶内，4℃冰箱保存备用。

4. 3%明胶液配制称取明胶30g，溶于0.9%灭菌生理盐水100ml中，114.3℃高压蒸汽10min灭菌，冷却后，4℃冰箱保存，临用时于37℃水浴预热10min。

5. 红细胞保存液(阿氏液，Alsever氏液)枸橼酸钠Na₃C₆H₅O_7.5H₂O 0.8g，葡萄糖2.05g，枸橼酸0.0325g，氯化钠0.42g，蒸馏水加至100ml。114.3℃高压蒸汽灭菌10min。

实验步骤

1. 血液标本的采集

测定血细胞免疫功能的试验以采静脉血为宜。采集血液最关键的是抗凝，选择什么样的抗凝方法，要根据实验的要求和条件而定。常用的抗凝方法有3种，操作方法如下：

    1) 机械去除纤维蛋白法：预先将适量的小玻璃珠(根据采血量多少而定)清洗后，装入采血容器中，灭菌后用于采血。采血过程中，边采血边轻摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中分散，去除纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但不需要特殊的试剂，又不影响血细胞活性，且可减少血小板混杂。

   2) 肝素抗凝法：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其钠盐或钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1000u/ml，4℃保存备用。采血前按每ml血液0.1~0.2mg或10~20u肝素加入采血容器，轻轻转动，使肝素溶液均匀润湿采血容器壁，然后进行采血，采血时要轻而缓慢地不断摇动采血容器。

   3) 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法：作为螯合剂的EDTA可与血液中钙离子结合而抗凝。常用其钠盐，一般先用生理盐水配制成4%的溶液，采血前按每ml血液1~2mg加入采血容器，然后进行采血，并不断缓慢摇动采血容器。

2. 淋巴细胞的分离及采集

   1) 自然沉降法：取肝素抗凝血20ml，加3%优质明胶10ml，于37℃水浴中静置30~45min，使细胞下降，然后吸取上层血浆和白细胞的混合物，以2 000r/min离心沉淀10min。弃上层血浆，管底细胞用Hanks液洗涤两次后，用细胞营养液4ml配成淋巴细胞悬液，淋巴细胞数约为5×10⁶个/ml。

   2) 密度梯度离心法：

      a. 将抗凝血20ml加等量Hanks液混合，沿管壁用毛细管慢慢加到20ml分层液于抗凝血表面后(切不可颠倒混合)，置水平离心机，以2 000r/min离心20min，可出现分层；

      b. 用毛细管仔细将血浆和分层液之间较薄、但比较清楚的乳白色淋巴细胞层吸至含5ml Hanks液的试管中，混匀后，以1 000r/min离心10min，弃上清后，再用Hanks液洗一次；

      c. 尽量吸去上清液，将沉于管底的淋巴细胞小块摇散，做细胞计数，用Hanks液配成5×10⁶个/ml的淋巴细胞悬液。

3. 红细胞的分离及采集无菌采取血液，加入阿氏液中,以2 000r/min离心10min，连续离心洗涤三次后，取压积红细胞，配成所需的红细胞悬液即可。