pⅧ噬菌粒库的构建

实验概要

本实验构建了pⅧ噬菌粒库，主要包括：载体的准备，插入片段的准备，连接插入片段与BstⅪ消化的p8V5载体及扩增与储存。

主要试剂

p8V5噬菌粒载体(AHymaxlnc)

LB氨苄青霉素培养基(1％蛋白胨，0，5％酵母提取物， 0.5％ NaCl，100ug/m1氨苄青霉素)

BstⅪ限制性内切酶(New England biolabs)

10 × NEBuer 3缓冲液 (0.5m01/L Tris-HCl，25℃时调节其pH为7.9， 1mol/L NaCl， 100mm01/L MgCl₂，10mmol/L二硫苏糖醇)

酚：氯仿(1：1)

TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH 8.0)

乙酸钾溶液(分别按10％、15％、 20％、25％质量体积比溶于2mmol/L EDTA溶液中，加溴化乙锭至终浓度为1ug/m1)

Qiagen P1asmid Maxi Kit(Qiagen)

3mol/L乙酸钠溶液，25℃时调节其pH为5.4

TBE缓冲液 (0.089mol/L Tris-HCl， 0.089mol/L硼酸， 2mmol/L EDTA， pH 8.3)

8％聚丙烯酰胺/7mol/L尿素/TBE凝胶

2×Prep TBE-urea上样缓冲液 (Invitrogen)

BstⅪ、BsiHKAI限制性生内切酶(New England biOlabs)

5 X DNA聚合酶缓冲液(200mmol/l Tris-HCl，pH 7.5，100mmol/LMgCl₂， 250mmol/LNaCl)

DNA聚合酶2.0(sequenase) (Amet-Sham BiOSCiences)

脱氧核糖核苷酸三磷酸混合液(dNTP) (dNTP各为25mm01/L) Microspin S-200 HR柱(Amersham BiOSCience8)

10 X连接缓冲液(500mm01/L Tris-HCl， pH 7.8， 100mmol/L MgCl₂，100mm01/L二硫苏糖醇，1mmol/L三磷酸腺苷，500/(g/m1BSA)

T4DNA连接酶(NewEnglandBl01abs)

E.coli MCl061 F’菌株(Aflyrllaxlnc)

superbroth培养基(3.5％蛋白胨，2％酵母提取物，0.5％NaCl，通过NaOH调节pH至7.5)

SOC培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mmol/LNaCl，2.5mmol/L KCl， 10mm01/L MgCl₂， 10mm01/L MgSO₄，20mm01/L葡萄糖)

LB氨苄青霉素培养基

3mol/L乙酸钠

SOPamp/glu培养基[2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mmol/LNaCl，15mmol/L K₂HPO₄，5mmol/L MgCl₂， pH7.2，100ug/m1氨苄青霉素，0.2％(w/v)葡萄糖]

LB培养基/15％甘油(体积分数)

VSC-M13辅助噬菌体(Stratagene)

20％(w/v)阿拉伯糖

20mg/m1卡那霉素(Kan)

PEG/NaCl(20％聚乙二醇，PEG平均分子量8000，2.5mmol/LNaCl)

磷酸盐缓冲液(PBS) (0.137mmol/L NaCl， 3mmol/LNa₂HPO₄，L4mm01/L KH₂PO₄，27mmol/LKCl，25℃调节pH为7.4)

SOP amp/glu培养基

主要设备

荧光氧化铝薄层层析板(J.T.Baker)

Microspin Sephadex G-25柱 (Aruer-Sham BiOSCiences)

电转化仪(E.coli pulser，BiORad)

13 ml离心管(Sarstedt)

实验步骤

1. 载体的准备

   1) p8V5噬菌粒载体DNA提取及用BstⅪ限制性内切酶消化

      a. 挑取单克隆MCl061p8V5菌株到5ml LB氨苄培养基中，于37℃振摇培养6～8小时，将培养物加入到含有1LLB氨苄培养基的2.8LFernbach大型锥形瓶中，37℃振摇培养过夜。

      b. 依照产品说明，用QiagenPlasmid Maxi柱提取双链噬菌粒质粒DNA，可得到约1mg双链噬菌粒载体DNA。

      c. 将200ug p8V5DNA，40ul 10×NEBuffer 3缓冲液和20ul BstⅪ限制性内切酶(200单位)混合，调整终体积为400ul，于55℃酶切过夜。

      d. 上述反应物用等体积的酚；氯仿抽提两次，再用氯仿抽提一次。

      e. 抽提物中加入40ul 3mol/L乙酸钠溶液和880ul乙醇，以沉降DNA。于室温离心10分钟后，小心去除上清，DNA沉淀用40ul TE缓冲液重悬。

   2) 乙酸钾梯度离心

      a. 缓慢地按浓度递减逐层加入上述乙酸钾溶液各1ml于13mm×55mm异质同晶聚合物(polyallomer)超高速离心管中。小心在上层加入200ul消化过的p8V5，使用SW50.1转子于20℃28000g(48000r/min)离心3小时。

      b. 在手提紫外灯下观察离心管中线性化DNA条带的位置。用注射器逐层吸出条带，用水饱和的丁醇抽提数次以除去溴化乙锭。

      c. 将上述抽提物的水相与0.1倍体积的3mol/L乙酸钠溶液以及2倍体积的乙醇混合，室温离心10分钟以沉降DNA。小心除去上清后，沉淀用70％乙醇洗涤后重悬于TE缓冲液中。于260nm测定DNA溶液的吸光度值以确定DNA溶液的浓度。

2. 插入片段的准备

   1) 寡核苷酸的合成及纯化

      a. 按照下列序列合成寡核苷酸片段。

      ON-1： 5’-GGCCCAGTGCTCACGCA(NNK)_nGGAGGCGGGGGTAGC-3’

      N为A、G、C、T(等物质的量)①，K为G、T(等物质的量)，n为所需要的随机氨基酸的个数。

      ON-2：5-TAGGGCCCACCTTGCTGGGATCGTCGGAGCCACCTCCCCCACTTCCCCC ACCGCCGCTACCCCCGCCTCC-3’

      b. 用2m1 30％NHOH将合成的寡核苷酸片段从合成柱上洗脱，并于55℃放置过夜以脱去DNA合成保护剂。冷冻干燥未经提纯的已脱保护的寡核苷酸片段，并用400ul水重悬。于260 nm测定DNA溶液的吸光度值以确定DNA溶液的浓度。

      c. 将500Pg两个寡核苷酸片段分别加入到与之等体积的2XPrepTBE-urea上样缓冲液中，并上样于8％聚丙烯酰胺/7mol/L尿素/TBE凝胶(24cm×l5cm，1.5mm封边垫条)的2cm加样孔中。其中一个加样孔中加入含有二甲苯腈的上样缓冲液，作为指示。

      d. 在500V的电压下电泳直至二甲苯腈移动到凝胶的最底端。取出凝胶并将其放置在荧光氧化铝薄层层析板的塑料包装上。通过短波手提紫外灯，可观察到寡核苷酸所形成的暗带。将带切下，放入一个离心管中，并将其捣碎。加入1m1水室温过夜，以洗脱DNA。

      e. 简单离心以沉淀聚丙烯酰胺凝胶碎片。将上清液转移到一个新的离心管中，并用真空离心蒸发浓缩器减少溶液的体积至约200ul。然后通过Microspin Sephadex G-25柱将寡核苷酸片段脱盐。

      f. 收集流出液，通过真空离心蒸发浓缩器分别将每个样品干燥，用水将干燥物重悬。于260nm测定DNA溶液的吸光度值以确定DNA溶液的浓度。

   2) DNA补齐反应和限制性内切酶酶切

      a. 在离心管中混合以下物质：

      100pmol ON-1

      100pmol ON-2

      10ul 5×DNA聚合酶缓冲液

加水补齐反应总体积至45ul

      b. 于70℃孵育5分钟并缓慢降低温度到室温，使两个寡核苷酸片段退火。

      c. 加入2.5ul 25mmol/L dNTP混合物，并加入2.5ul DNA聚合酶2.0(32单位)。于 37℃孵育1小时。

      d. 于70℃孵育10分钟以使DNA聚合酶失活。使用MicrospinS-200 HR柱，通过凝胶过滤层析的方法除去未反应的dNTP。

      e. 将40ul补齐后的反应物与20ul NEBuffer 3缓冲液混合。加入10ul BstⅪ和10ul Bis HKAI限制性内切酶，加入120ul水。于55℃放置于有盖水浴锅内酶切过夜。

      f. 上述反应物用等体积的酚：氯仿抽提两次，再用氯仿抽提一次。使用MicrospinS-200 HR柱，通过凝胶过滤层析纯化消化后的片段。于260nm测定DNA溶液的吸光度值以估算DNA溶液的浓度。

3. 连接插入片段与BstⅪ消化的p8V5载体

   1) 连接反应

      a. 在13m1离心管中混合下列物质：

      20ugp8V5载体(经BstⅪ酶切和纯化)

      1.25ug插入DNA片段(经BstⅪ、Bsi HKAI酶切和纯化)

      200ul 10×连接缓冲液

      4ul T4 DNA连接酶

加水至反应总体积为2m1

      b. 于14℃孵育过夜。加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液和2倍体积的乙醇。于10000r/min转速(JA.20转子)下离心15分钟。除去上清，用400ul TE缓冲液将沉淀重悬。再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液和2倍体积的乙醇，离心后将沉淀用70％乙醇洗涤并干燥，再加入20ul TE缓冲液将连接后的DNA重悬。

   2) 准备电感受态细胞

      a. 培养E.coli MCl061 F菌株于1L superbroth培养基直至对数生长期中期(OD₆₀₀＝0.5)。

      b. 在冰上冷却培养物30分钟。于4℃、5000 r/min转速(JA.20转子)下离心细菌悬液15分钟。

      c. 用1L冷水将细菌沉淀重悬。重复上面离心步骤，用0.5L冷水将细菌沉淀重悬。

      d. 重复上面离心步骤，用10ml 10％甘油将细菌沉淀重悬。于4℃6000r/min转速下离心细菌悬液15分钟。

      e. 用10％甘油重悬细菌沉淀，至终体积为2m1。按每管200/ul分装后先于干冰转移到-70℃冷冻保存。

   3) 电转化

      a. 准备4个转化反应，其中每个电转化杯中含有200ul细菌和5ul连接后的DNA，于2.5kV电压下电转化。转化后，立即将细菌转移到2m1SOC培养基中，在无选择压的条件下于37℃培养1小时。

      b. 将4个转化反应产物混合，并将取出少量产物以10倍递减稀释。将100ul 10^-4-10^-5。

稀释液涂布于LB氨苄青霉素琼脂培养基平板上，根据菌落生长数计算转化的效率。剩余的转化反应产物加入到500m1SOPamp/glu培养基中，于37℃振摇培养直至OD600值达到0.8。

      c. 取100m1上述培养物，从库中生成噬菌体。剩余的细胞悬液于6000r/min转速下离心10分钟。

      d. 用10m1LB培养基/15％甘油重悬细菌沉淀，将其转移到Nunc冻存管中，每管1m1，并将其于-70℃冷冻保存，以备将来扩增库之用。

4. 扩增与储存

   1) 辅助噬菌体感染和pⅧ诱导产生

      a. 按10:1感染重数加入VSC-M13辅助噬菌体[约1012空斑形成单位(pfu)]到100ml 已转化的细菌中。于37℃静置孵育30分钟。

      b. 将上述培养物加入到一个含有500mlSOPamp/glu培养基的三角瓶中。加入0.6 m1卡那霉素溶液和6ml 20％阿拉伯糖溶液。于37℃振摇培养过夜。

   2) 收集扩增后的噬菌粒库

      a. 于4℃ 12000g转速(对于JA-10转子为8000r/min)将上述过夜培养物离心。将上清转移到一个新的离心管中，并再次离心。

      b. 将上清转移到另一个新的离心管中，加入0.2倍体积的PEG/NaCl以沉降噬菌体。充分混合后冰上静置1小时。

      c. 于8000r/min离心15分钟将噬菌体沉降。小心将上清除去，用10ml PBS将噬菌体沉淀重悬。滴定噬菌体储液；滴定结果出来前，噬菌体悬液可在4℃短期保存24小时。若需要长期保存，可将噬菌体悬液以1000倍库当量，于-20℃分批冻存。