实验概要
本实验利用了花序真空渗透法转化拟南芥,并进行了抗性筛选。
主要试剂
卡那霉素,YEB培养基,菌株EHA105,1/2 MS液体培养基,表面活性物质L-77 Silwet
主要设备
摇瓶,摇床,高速离心机,生长室
实验步骤
1. 将表达载体pBI121::AtMYBl,导入农杆菌EHA105
本研究选用农杆菌介导的基因转化方法。我们将转化单元导入Agrobacterium tumefaciens EHA105中,涂YEB板(含卡那霉素Km 50 ug/ml ),28℃倒置培养约48 h。提取质粒并酶切验证,获得转化成功的菌株,供转化拟南芥使用。
2. 花序真空渗透法转化拟南芥及其抗性筛选
1) 将活化的带有pBI121::AtMYB15质粒的A. tumefacien,菌株EHA105在YEB液体培养基(含Km 50 ug/ ml )中于28℃摇瓶培养过夜;
2) 按1%的量转接,大量摇瓶培养至OD600约为0.7;
3) 4℃,5000 rpm离心10 min,收集菌体;用1/2 MS液体培养基洗涤沉淀,再按上述条件离心,收集菌体;
4) 然后用1/2 MS液体培养基悬浮菌体至109cfu/ml;
5) 待Col-0生长到盛花期时,将盆钵倒置,使拟南芥花浸入上述菌悬液中(含0.02%表面活性物质L-77 Silwet ),真空抽滤15 min,使菌液渗入花中;
6) 取出后于生长室中继续培养至种子成熟,收种。
7) 由于拟南芥开花时间不一致,可重复抽滤3-4次。
8) 用Km抗性筛选沉默植株,在MS Km ( 50 ug/ml)的平板上生长约12d后,挑选生长正常且根较长的绿色幼苗(T0代)移栽到土壤中,正常培养。
9) 种子成熟后进行单株收种(T1代,具有RR,Rr,rr型),T1代种子继续在Km抗性平板上筛选,根据孟德尔遗传第一定律统计分析,筛选获得T2代纯合品系。