实验概要
本实验采用花浸泡法利用农杆菌介导将目的基因转入拟南芥。
主要试剂
YEB液体培养基,LB培养基,0.1 M CaCl2,0.05 M MgSO4,花浸泡缓冲液(0.5XMS,5%蔗糖,0. 03%Silwet L-77 ),Rif,Kan
主要设备
摇床,离心机,培养钵,温室,托盘,塑料薄膜
实验材料
已构建好的表达载体,拟南芥
实验步骤
1. 农杆菌感受态细胞的制备和转化
1) 挑取GV1301单菌落于10 ml YEB或者LB液体培养基中,28℃振荡培养至对数晚期;
2) 取0.5 ml菌液加入50 ml新鲜YEB或者LB液体培养基中,28℃振荡培养至OD600=0.5;
3) 转移至50 ml离心管中,冰浴20 min;
4) 转移至50 ml离心管中,冰浴20 min;
5) 4℃,4000 rpm离心10 min,收集菌体;
6) 沉淀用8 ml预冷的0.1 M CaCl2和0.05 M MgSO4重悬;
7) 4℃,4000 rpm离心10 min,收集菌体;
8) 取200 ul感受态细胞,加入0.5 ug质粒,轻轻混匀;
9) 液氮冷冻50 s,冰上放置40 min,42℃热激90 s;
10) 加入800 ul LB培养基,28℃恢复培养1 hr;
11) 涂布适量的细胞于筛选培养基上,超净台吹干表层液体;
12) 28℃培养两天。
2. 花浸泡法转化拟南芥
1) 接种含有表达载体的农杆菌克隆于5ml YEB培养基(含100 ug/ml Rif,100 ug /ml Kan)中,28℃,200 rpm,振荡培养过夜;
2) 按1:50的比例转接到200 ml YEB培养基中28℃,200 rpm培养5 hr;5000 X g,离心15 min,收集菌体;重悬于花浸泡缓冲液(0.5XMS,5%蔗糖,0. 03%Silwet L-77 ),调OD600至0. 8。
3) 将拟南芥培养钵倒置于装有花浸泡缓冲液的合适大小的容器上,浸泡3-5min,取出培养钵倒置于托盘中,用塑料薄膜覆盖托盘,24 hr后取下薄膜,于温室中继续培养。