实验概要
本实验介绍了用LiCl法将重组质粒导入毕赤酵母菌X-33的转化方法。
主要试剂
甘油,YPD培养基,50% PEG,1 mol/L LiCl,Sac I
主要设备
摇床,高速离心机,1.5 ml微量离心管,水浴锅
实验材料
重组质粒pPIC6αA-APC,毕赤酵母菌X-33
实验步骤
1. 取毕赤酵母甘油种400 ul至50 ml YPD培养基中,30℃振荡培养(8-10 h)至OD600~1.0;
2. 离心1500 r/min,10 min,收集新活化好的酵母细胞;
3. 再用25 ml无菌蒸馏水冲洗,室温下1500 r/min离心10 min,弃去水;
4. 用lml 0.1 mol/L LiCl重悬细胞,转入1.5 ml微量离心管中,高速离心(10000 r/min,15s)后收集细胞;
5. 用400 ul 0.lmol/L LiCl重悬细胞,每管50 ul分装于1.5 ml eppendorf管中,高速离心(10000 r/min,15 s,用吸管吸去LiCl;
6. 依次加入下列试剂:240 ul 50% PEG,36 ul 1 mol/L LiCl,25 X12 mg/ml单链DNA,Sac I线性化pPIC6αA-APC (5-10 mg)置于50 ul无菌蒸馏水,振荡混匀细胞,30℃静置孵育30 min;
7. 于42℃水中热休克20 min;
8. 8000 r/min离心3 min,吸去转化液,用1 ml YPD重悬细胞,30℃摇床孵育(1-4h);
9. 取200 ul上述转化菌液于YPD固体培养基中(加入Blasticidin,再取200 ul于YPD固体培养基中(不加Blasticidin)作对照,30℃孵育2-3 d到出现转化菌落。另取30ul新活化酵母菌液于YPD固体培养基(加入Blasticidin)作对照;再将Sac I酶切的质粒DNA 30 ul于YPD固体培养基(不加Blasticidin)作对照。30℃孵育2-3 d,观察结果。