实验概要
本实验提供了一个心脏组织2-DE蛋白样品制备及检测的流程,为蛋白质双向电泳实验做好准备。
实验步骤
1. 心脏组织2-DE蛋白样品的制备
1) 将冷冻的小鼠心脏组织在液氮条件下研磨成粉末;
2) 然后加入5 x体积蛋白裂解液(7 M Urea, 2 M Thiourea, 40 mM Tris, 4 % CHAPS, 65mMDTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 mM protease inhibitor cocktail, 0.5% Pharmaltes, pH3-10),用Teflon匀浆器匀浆组织1 min,超声匀浆30s;
3) 室温放置10 min,4oC;
4) 14,000 g离心30 min,收集上清,-80oC储存备用。蛋白质裂解液保存在-20oC冰箱里备用。
2. 蛋白质含量测定
按Amersham 2-D Quant Kit操作说明进行:
1) 取3ul蛋白样品进行定量,每管样品加入500ul沉淀剂(precipitant),漩涡振荡,室温下放置2-3 min;
2) 加入500 ul共沉淀剂(co-precipitant),混匀;
3) 4℃,10,000 g离心5 min;
4) 弃上清,尽量没有可见液体残余,加入100ul铜溶液(copper solution),和400ul去离子水,漩涡振荡使蛋白沉淀溶解;
5) 加入1 ml显色工作液(working color reagent, color reagent A :color reagent B=100:1),快速混匀,室温下放置15^'20 min; 490 nm处测定吸收峰;
6) 所得结果根据标准曲线计算样品蛋白含量。