实验概要
掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA;和菌落PCR快速鉴定克隆。
实验原理
在这个实验方法中,只需配制一种细胞缓冲液(它可以在室温下保存,长期使用)。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂---SDS在37℃溶解膜蛋白,使细胞破裂,并解聚核蛋白,SDS还能与蛋白质结合形成复合物,使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子,防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心,去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白,将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中,有染色体DNA,不同大小的质粒DNA和RNA,它们都可以经肉眼观察或拍照显示。
或者用设计好的引物,做菌落PCR快速鉴定克隆。
主要试剂
1、破碎细胞缓冲液 50mmol/L Tris-HCl (pH6.8) 1% SDS 2mmol/L EDTA 400mmol/L蔗糖 0.01%溴酚蓝 配制方法:1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10毫升 20% SDS 10毫升 250mmol/L EDTA 1.6毫升 蔗糖 27.2克 1.2%溴酚蓝 1.67毫升 加ddH2O至200毫升
2、10mg/ml 溴乙啶 3、TBE电泳缓冲液(5×) 4、Taq DNA聚合酶 5、10×反应缓冲液(含25mmol MgCl2) 6、dNTP 7、点样缓冲液Loading buffer(10×):0.25%溴酚蓝,40%甘油。
主要设备
1、电泳仪 2、1.5ml 离心管 3、Tip 4、培养皿 5、PCR扩增仪 7、台式离心机 8、紫外分析仪 9、恒温水浴
实验步骤
一、快速细胞破碎法测定 1、取1.5ml离心管编号码,每管加入50ul破碎细胞缓冲液。 2、取一培养皿在底部标记如图所示 3、待转化的细菌菌落长到2mm时 4、用牙签挑取单克隆将菌落点在作好标记的方格内,然后将牙签加入对应的培养管中(培养管中含5ml LB液体培养基)。 5、培养皿37℃×6 h后4℃保存。培养管37℃×12 h左右。 6、用培养管中的菌液提取质粒。 7、酶切电泳检查质粒。
二、菌落PCR快速鉴定法 1、直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入25ul或50ul PCR反应体系中。 2、用通用引物或特异引物进行PCR,根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向(反应体系参照前面实验)。
试剂 | 体积( 50ul) |
ddH2O | 37ul |
10 x buffer | 5ul |
10×dNTP | 5ul |
Primer P1 | 1ul |
Primer P2 | 1ul |
模板 | 1个菌落 |
Taq 酶 | 1ul |