实验概要
将RNA 或DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜上,同探针进行杂交,用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究,称为斑点印迹。与Southern 及Nouthern 印迹法相比,其优点是简单、迅速,可在一张膜上同时进行多个样品的检测,特别是对于核酸粗提样晶的检测。缺点是不能鉴定所测基因的分子量,特异性不高,有一定的假阳性。
主要试剂
southern、northern杂交试剂、RNA提取试剂
DNA提取试剂
实验步骤
RNA点杂交
1) 纯化的RNA的点杂交和狭线杂交
安装印迹装置
1.切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿,在20×SSC中室温泡1 h。
2.在膜浸泡期间,先用0.1 mol/L NaOH小心清洗印迹装置,再用无菌水洗干净。
3.把两片厚滤纸用20×SSC浸湿,再放到真空器顶部。
4.把样品槽插入装置的上部,把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部,用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。
5.加紧夹板,连接真空管。
6.加入10×SSC直至液面没过尼龙膜,关掉真空,再用10×SSC充满。
RNA样品准备
1.把每个RNA样品(溶解在10μl水)分别与30μl RNA变性液混合。
2.65℃温育5 min,然后在冰上冷却。
3.向每个样品中加入等体积20×SSC。
4.轻轻向印迹装置中吸入10×SSC,直到淹没尼龙膜。
RNA样品的印迹和RNA在膜上的固定
1.把所有样品轻轻加入狭线中,然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后,每个狭线用1 ml 10×SSC洗两次。
2.当第二次洗膜完成后,继续轻轻吸干膜。
3.取下膜,用紫外交联、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。
固定化RNA的杂交与洗膜
1.把膜放入烤盘或杂交炉中,加入10~20 ml预杂交液68℃温育2 h。
2.把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育12~16 h。
3.杂交完后从塑料袋中取出膜,然后尽可能快地把膜转移到室温下装有100~200 ml、1×SSC(0.1% SDS)的塑料容器中。盖紧塑料容器,放到摇床上轻摇10 min。
4.把膜转移到另一个装有100~200 ml、预热到68℃的0.5×SSC(含0.1% SDS)的塑料袋中,然后在此温度下轻摇10 min。
5.按步骤17重复洗膜两次,使总的洗膜次数达到三次。
6.用滤纸吸干膜,在-70℃条件下放射自显影24~48 h(Kodak XAR-5 或相当的胶片)。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然,磷光成像仪也可以用来成像。
2)RNA斑点印迹的制备(详见《分子医学技术》106页)
1.裁一张大小合适的滤膜,用软铅笔标记RNA加样的位置,一个cm的方格即可。
2.以20×SSC浸泡滤膜。
3.在65℃用以下溶液温育5min,使10~20μg的总RNA变性。
总RNA(10~20μg) | 2.0μl |
变性液 | 6.0μl |
置冰浴快速冷却5min,用微量离心管离心片刻以回收液滴,将管置于冰浴。
4.将滤膜铺在一叠经20×SSC浸泡过的滤纸(如Whatman 3MM)上。
5.在膜上点样,每孔4μl RNA,待一孔干燥后再加另一孔。
6.将滤膜置滤纸(3MM)上稍微晾干,用20×SSC漂洗片刻。
7.当滤膜仍潮湿时,将滤膜RNA面朝下在紫外线透照仪照射3~5min,使RNA固定于滤膜上,此滤膜已可用于杂交。
DNA点杂交
DNA斑点印迹的制备
预备
1.冰浴中以70W左右的超声波处理基因组DNA 1min,用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小,这些片段大小均应为7~10kb。
2.用TE缓冲液将DNA稀释至0.5μg/μl。
斑点印迹的制备
1.加热5μg DNA(在10μl TE缓冲液中)至95℃ 10min,冰浴5min。用微量离心管短暂离心收集液滴,置冰浴。
2.裁一张大小合适的滤膜,用铅笔在滤膜上画25px的方格网以标记DNA点样的位置。
3.滤膜先用蒸馏水稍微浸湿,并用20×SSC使其饱和。将膜放在经20×SSC预饱和过的滤纸(Whatman 3MM)上。
4.以5μl的DNA分装样品在滤膜上点样,待前一个样品干燥后再点第二个样品。
5.将滤膜放在一张干燥的滤纸(Whatman 3MM)上稍微晾干,以5×SSC漂洗5min。
6.将DNA固定于膜上,硝酸纤维素膜需置80℃真空烤炉2h。当尼龙膜仍潮湿时,应用Saran包装膜(或任何类似的塑料薄膜)包裹,将DNA面朝下置紫外透射仪上,紫外线(280mn)照射3~5min,这时的滤膜已可用于杂交。
注意事项
1、点杂交要防止膜的污染。
2、其它同southern,northern。