1. 96 孔板样本处理
1.1 操作流程
接种细胞:3×104 /孔 药物刺激 一般作用24 小时,上机
1.2 方法
在cellquest 环境下,利用control 细胞标定上样条件,并在已设好的文件
夹(INS 文件及SET 文件)下,保存好需要的上样文件 关闭cellqest 软件,
打开MPM 软件 在MPM 软件下进行一系列设定(首先在Autosample 下,
进行SettingInitial 及FinalWashing 操作,清洗整个管路 管路清洗完毕进行
上样条件设定(主要设定上样体积(一般100ul),混合体积(一般100ul),混合次数,
清洗次数等,在Acquisition 菜单下设定current plate(现在使用的板号是353263),
DateStorageFolder( 即数据储存文件夹) , AcquisitionDocument 及
InstrumentSettingsFile(上样条件从保存好的INS 及SET 文件中选定) 上样
条件设定完毕,选定96 孔板的上样范围 在Acquisition 下选择Acquire,
上样 上样完毕,退出上样板,使用次**钠及水,清洗管路(将次**钠
及水加在96 孔板上,以上样的方式清洗管路)
*须知:如果使用PBS 作为上样鞘液,上样完毕后,换用水作为鞘液,并反复冲
洗管路,防止PBS 盐结晶堵塞管路。
1.3 注释
1) 必需的control:应准备一管对于检测指标为阴性的细胞(例如:若要检测
Jurkat-NF-KB-GFP 经药物刺激样本,就需要准备一管Jurkat 细胞(GFP 为阴
性)),用于标定机器的上样条件。细胞量为1×106 个/ml,1ml。
2) 上机前,应对样本进行混合,以使样本均一(注意使用排枪吹打,勿产生气泡)。
3) 以上protocol 仅针对于悬浮细胞。
4) 药物刺激浓度需先做梯度检测。
第七章 流式细胞分析分选术
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2. Cell Cycle Assay
常用的实验细胞株包括:293(T),MCF7,U2OS,Saos,Hela 等
以U2OS 细胞为例
2.1 细胞培养及铺板
1) 细胞株及材料:
a) 细胞株: U2OS 细胞
b) 培养基: DMEM(10%FBS,GBICO),DMEM(无血清)
c) 培养器皿:75cm2 培养瓶,6cm 培养皿
2) 细胞培养及铺板:
a) 传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种U2OS 至75cm2 培养瓶,细胞长
满后铺板并传代。
注:一般一瓶细胞总数可以达到1×107 个
b) 铺板:
细胞消化:将培养好的U2OS 细胞,倾去培养基,加入2ml 1×胰酶轻轻
摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min,观察细胞从
瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞
成单个,或是只有2-3 个细胞聚团,即可以加入5ml 含有血清
的DMEM(10%FBS),终止胰酶的消化作用。
细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数。
细胞密度(单位:个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数
铺板: 6cm培养皿按照每孔6×105 个细胞(即1.5×105/ml,4ml)
细胞加入后将6cm 培养皿沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动
(手势一定要轻柔,防止培养液泼出),使细胞能够均匀分布,放置细
胞培养箱生长。
注:计算铺板量时,应将control 板,药物阳性对照板及质粒对照板考虑在内。
第七章 流式细胞分析分选术
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2.2 转染
1) 试剂及材料:
a) 转染试剂:Lipofectamin 2000
b) 质粒:对照质粒:pEF-BOS
p21(阳性对照)
p16(阳性对照)
GFP-spectin
目的基因质粒,构建在pEF-FN 载体上
注:若目的基因载体不是pEF-FN,则对应的空载体要相应变化。
2) 转染:细胞密度为50%-60%时,进行转染
A:0.3μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至终体积500μl/
孔。
B:9.9μL lipofectamine 2000+490.1μL serum free DMEM 体积为500μl /孔,室
温放置5min
A,B 二者混合,室温放置20-30min 后将混合液缓慢而均匀的加到6cm 板
细胞液中,每板为1000μL,轻轻摇晃,使DNA 分布均匀,转染5 小时后,
换置培养液(10%FBS+DMEM)。
2.3 细胞分板
细胞分板:转染12-16 小时后, 根据细胞密度按1:3 或1:2 分板,使分
板后细胞密度为30%左右,37℃继续培养30h。
2.4 加药刺激
除了利用转染质粒作为阳性对照,也可使用药物处理细胞作为阳性对照样本
细胞铺板24 小时后,加药刺激:
G1,S-arrest :L-mimosine: 0.5mM
5-fluorourcil: 10mM
G2/M arrest : nocodazole: 50ng/ml
第七章 流式细胞分析分选术
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加药后,继续培养24 小时
附注:作为阳性对照的基因及药物的具体使用情况见附表1。
2.5 细胞收获及处理
分别收集培养液,在每个6cm 板中加入1ml 胰酶消化(细胞消化的方法同上)。
消化完毕,加入已收集的培养液(注意一一对应,防止弄错)中和胰酶。离心(300g,
5min)收集细胞,弃上清,加入2-3ml 75%乙醇(细胞量较多,可酌量多加),votex,
充分混匀,放入-20oC 冰箱,保存。
2.6 上机样本制备
从-20oC 取出细胞样本(至少已在-20oC 放置4 小时),离心(300g,5min)收集细
胞,弃上清。1×PBS 清洗两遍,加入100ul 1×PBS,votex 混匀,加入10ulPI(终
浓度100ug/ml),10ulRnase(终浓度50ug/ml),置于37oC 水浴锅,避光处理30min。
注:细胞量较多时,PI 及RNase 量应酌量增加。
2.7 上机
在cellquest 环境下,选择FL-1(GFP)及FL-3(PI)作为研究对象,先上control
样本标定上样条件,进而上其他样本。
2.8 相关试剂的配制
1.1×PBS:采用GIBCO 1×10L D’PBS(Cat.No21600-069)配制。
2.PI:以水为溶剂,母液浓度为1mg/ml,配制完毕后,4oC 避光保存
3.Rnase:以水为溶剂,母液浓度为0.5mg/ml,配制完毕后,分装冻存于-20oC
4.L-mimosine: 以无血清培养液为溶剂,母液浓度为100mM,配制完毕后,
4oC 避光保存
5.5-fluorourcil:以DMSO 为溶剂,母液浓度为549mM,配制完毕后,4oC 保
存
6.Nocodazole:以DMSO 为溶剂,母液浓度为5mg/ml,配制完毕后,4oC 保存
第七章 流式细胞分析分选术
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附表1:阳性对照基因及药物
3.FACS analysis on Apoptosis
可用于凋亡检测的细胞,多为对细胞凋亡较为敏感的细胞,例如:MCF7, Hela
以Hela 细胞为例
3.1 细胞培养及铺板
1) 细胞株及材料:
i. 细胞株: Hela 细胞
ii. 培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)
iii. 培养器皿:75cm2 培养瓶,6cm 培养皿
2) 细胞培养及铺板:
a) 传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种hela 细胞至75cm2 培养瓶,细胞
长满后铺板并传代。
注:一般一瓶细胞总数可以达到3×107 个
b) 铺板:
i.细胞消化:将培养好的Hela 细胞,倾去培养基,加入2ml 1×胰酶轻
轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min,观察细
胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测
基因 药物
G0/G1 P21,P16 L-mimosine: 0.5mM
S 5-fluorourcil: 10mM
G2/M nocodazole: 50ng/ml
第七章 流式细胞分析分选术
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到细胞成单个,或是只有2-3 个细胞聚团,即可以加入5ml
含有血清的DMEM(10%FBS),终止胰酶的消化作用。
ii.细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数。
细胞密度(单位:个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数
iii.铺板: 6cm 培养皿按照每孔3×105 个细胞(即0.75×105/ml,4ml)接种,
细胞加入后将6cm 板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(手势一定
要轻柔,防止培养液泼出),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长。
注:计算铺板量时,应将control 板,药物阳性对照板及质粒对照板考虑在内。
3.2 转染
1)试剂及材料:
转染试剂:Lipofectamin 2000
质粒: a:对照质粒:pEF-BOS
RIP(阳性对照)
b:GFP-spectin
c:目的基因质粒,构建在pEF-FN 载体上
注:若目的基因载体不是pEF-FN,则对应的空载体要相应变化。
2)转染:细胞密度为50%-60%时,进行转染
A:0.15μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至终体积500μl/孔。