一、材料和试剂
1、0.01M PBS(pH7.4)： NaCl 8.0g； KCl 0.2g； Na2HPO4 1.44g； KH2PO4 0.24g； ddH2O至1000ml ； 高压灭菌,分装。
2、0.25%胰酶：称取EDTA 0.02g NaCl 0.8g KCl 0.04g 加三蒸水100ml溶解后加0.25g 胰酶,轻轻搅动,使胰酶溶解,不要产生泡沫,加酚红少许,调PH值到8.2-8.6,过滤除菌,分装10ml/管,-20℃保存,临用前预温到37℃。
3、诱导液(TPA)：12-邻-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)溶于丙酮，配成20mg/ml。
二、实验步骤
(一) 、用96孔细胞培养板制备贴壁细胞抗原(正常贴壁细胞)
1、HFF,NIH3T3细胞用含10%血清DMEM完全培养液在75cm2培养瓶中单层培养,使密度达到90%
2、倾去培养液,用无菌PBS液5-10ml洗细胞一次,用无菌吸管吸干PBS液。
3、加0.25%胰酶(从-20℃取出,在37℃预温)75平方厘米培养瓶加1ml,37℃温箱或有经验者可在酒精灯周围,控制温度约37℃左右,轻轻摇匀使胰酶充分覆盖细胞表面。
4、观察到细胞有松动,成流沙状下落;或在显微镜下观察,细胞已有收缩变圆时,用无菌PBS液15-20ml,终止反应。
5、轻轻吹打下细胞,使细胞单个分散,并充分混匀1500转/分离心5-10分钟,去掉上清液
6、打散细胞,加10ml含血清DMEM完全培养液混匀,取10ul在显微镜下计数,计算细胞浓度。
7、用含10%血清培养液调整细胞浓度至1×104个/100ul,每孔(96孔)接种200ul(即2×104个细胞/孔),37℃ CO2培养箱培养。
8、次日显微镜下观察,细胞是否完全贴壁(一般24小时可完全贴壁)倒去培养 0.01M PBS液先二次(孔中加满PBS,轻轻倒掉)并在滤纸上扣干,反复3次)应 注意加液的力度,不能太大,以免冲掉细胞,倒去上清液在滤纸上扣干水份,但保持细胞湿润。
9、加90%冷丙酮固定,每孔200ul,5-10min 摔去冷丙酮,用PBS洗三次,扣干。
10、在培养板上作好标记(细胞名称,制备时间)。
11、保鲜膜封好,-70℃保存。
(二) 、悬浮细胞玻片法的抗原制备
1、 25平方厘米玻璃瓶用含10%血清的1640完全培养液培养BCBL-1细胞,密度达到80-90%
2、加样枪充分吹匀细胞,收集于离心管中。
3、1500转/分离心5-10分钟,弃去上清液。
4、打匀细胞,用PBS洗二次,弃去上清。
5、打匀细胞,加少量PBS液(根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计)混匀,取少量在显微镜下计数,调整浓度,估算在玻片上每个细胞涂片圈位 (12圈)接种细胞1×104个。
6、室温下干燥,然后加100%的冷丙酮室温固定3-5分钟,PBST洗二遍。
7、室温干燥,作好标记然后放入玻片盒 ,玻片盒用塑料袋密封,并放一袋防潮剂,-20℃保存,一个月内有效。
(三) 病毒感染细胞抗原的制备
1、96孔培养的贴壁细胞的病毒感染及病毒抗原的制备
1) 未感染细胞接种到96孔板(方法见”悬浮细胞玻片法抗原制备”1-5步),并完全贴壁。
2) 摔去PBS液,加入少量病毒液(加入量由先做棋盘试验来确定浓度,或先测定病毒滴度而定,且病毒液用2%-5%血清DMEM完全培养液稀释),每孔50ul,摇匀,使充分覆盖细胞表面 ,37℃ CO2培养箱培养（MCMV感染NIH3T3 HCMV感染HFF）。
3) 每天观察细胞形态变化,早期CPE为细胞肿胀,中期聚集,晚期则圆缩。
4) 当圆缩细胞达到10%-30%左右,细胞层出现明显的病灶,同时还有正常细胞未感染,即可收获(一般情况下3-4天)。
5) 倒去上清(倒入有消毒液容器以防止污染环境),用无菌PBS液洗2次(加满培养孔,倒掉,在滤纸上扣干)。
6) 倒去上清,加90%冷丙酮室温固定5-10min,每孔200ul 。
7) 摔去冷丙酮,用PBS洗三次,扣干。
8) 在培养板上作好标记(病毒抗原名称,制备时间等)。
9) 保鲜膜封好,-70℃保存。
2、BCBL-1细胞的诱导和KSHV病毒抗原的制备
<1> BCBL-1细胞扩大培养，细胞密度达到50%
<2> TPA（12-0-酰佛波醇-13-乙酸酯），每毫升培养液加40ug（TPA预先配成 20mg/ml）。
<3> 诱导三天后，收集少量细胞进行ICC预实验。
<4> KSHV阳性细胞达到10%-30%时，可做细胞涂片，阳性细胞>30%时,可用于制备病毒细胞裂解液。
<5> KSHV阳性细胞达到10%-30%时,即可收获细胞加样枪充分吹匀细胞,收集于离心管中。
<6> 2000转/分离心5-10分钟,弃去上清液。
<7> 打匀细胞,用PBS洗二次,弃去上清。
<8> 打匀细胞,加少量PBS液(根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计)混匀,取少量在显微镜下计数,调整浓度, 估算在玻片上每个细胞涂片圈位 (12圈)接种细胞1×104个。
项目 MCMV HCMV KSHV
血清稀释度 1:50 1:100 1:200 1:100 1:500 1:1000 1:50 1：100 1:200
测血清用二抗
HRP-Anti Mouse IgG(fc) Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma Bio-Anti mouse IgG F(ab’)2 Sigma HRP-Anti Mouse IgG(fc) Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma
测上清用二抗 Bio-Anti mouse IgG F(ab’)2 Sigma Bio-Anti mouse IgG F(ab’)2 Sigma HRP-Anti Mouse IgG(fc) Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma
<9> 室温下干燥,然后加100%冷丙酮室温固定3-5分钟,PBST洗二遍。
<10>室温干燥,作好标记后放入玻片盒,玻片盒用塑料袋密封,并放一袋防潮剂,-20℃保存,一个月内有效。
三、说明
1、 测病毒细胞ICC血清稀释度及使用的二抗
2、细胞病变作用分三种类型
1) 全变型：即整个细胞都发生改变。
<1>整个细胞都发生肿胀,胞浆呈颗粒样变,胞膜边缘不整齐。
<2>整个细胞都发生皱缩,变圆直至碎裂,脱落等,多见于病毒。
2) 包涵体型：即反映在细胞核或细胞浆内出现病毒引起的包涵体。。
3) 融合型：即指多数病变细胞发生相互事例融合而呈”巨细胞”,但单个细胞的胞核仍可分辨。
3、细胞病变程度表示方法
通观整个”单层区”权衡总的情况,双下列符号表示其病变程度:
无细胞病变
+ 25%以下的细胞有病变
++ 25%-50%的细胞有病变
+++ 50%-75%的细胞有病变
++++ 75%-100%的细胞有病变
四、注意事项
1、病毒液应保存在-70℃,4℃保存病毒液病毒滴度会降低,保存不长久。
2、每次从冰箱取出抗原板或抗原片时,应在37℃预温去掉水雾,用前要用3%的双氧水(现配现用)除掉病毒细胞中的内源性过氧化物酶。
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