RT-PCR实验步骤

一、组织抽提：

1.       取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末

2.       移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆

3.       移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打

4.       冰上孵育5分钟

5.       离心12,000g  4℃  5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管

6.       加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟

7.       离心<12,000g  4℃  10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管

8.       加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟

9.       离心<12,000g  4℃  5分钟 弃去上清液

10.   加入1 ml 75%乙醇，震荡

11.   离心<7,500g  4℃  5分钟 弃去上清液

12.   室温下使之变透明

13.   加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）

14.   走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度

二、RT反应体系（第一步）：约20分钟

1.       65℃ 15分钟

2.       立即放入冰浴

RT反应体系（第二步）：约2小时

1.       37℃ 1.5小时

2.       94℃ 5-10分钟

3.       反应物保存于-20℃或进行PCR

三1、PCR反应体系：约4.5小时

1.       94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环

2.       94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环

3.       72℃ 10分钟

4.       取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳

三2、PCR反应体系：约5小时

1.       94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环

2.       94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环

3.       72℃ 10分钟

4.       取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳

四、电泳：约1.25小时