DNA琼脂糖凝胶电泳
实验方法原理 |
利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有的电荷效应和分子筛效应。 电荷效应是指DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电,在电场中向正极移动,且相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,能以相同速率移动。通常,DNA泳动速率随DNA片段长度的增加而减少,与电场强度成正比。 分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖,具有网络结构,使大分子物质在通过时收到较大阻力,依此分离不同大小的DNA片段。一般,DNA琼脂糖凝胶电泳可分离50bp到百万bp长度的DNA片段,视实际需求配制不同浓度和构型的琼脂糖凝胶。 |
---|---|
实验材料 | DNA样品 |
试剂、试剂盒 | 琼脂糖 电泳缓冲液 溴化乙锭 上样缓冲液 |
仪器、耗材 | 电泳仪 电泳漕 透射紫外灯 胶带纸 紫外成像仪 |
实验步骤 |
一、标准琼脂糖不同浓度分离DNA片段的范围
0.5 700bp~25kb 0.8 500bp~15kb 1.0 250bp~12kb 1.2 150bp~6kb 1.5 80bp~4kb 二、电泳缓冲液配制 以Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液(pH8.0,TAE)为例
TAE 1X 50X 40 mmol/L Tris-乙酸盐 242g Tris 1 mmol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸 100 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 三、琼脂糖凝胶制备
四、DNA电泳
展开 |
注意事项 |
1. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。 2. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,熔化的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,以免影响电泳结果。 3. 电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和pH,应经常更新电泳缓冲液。 4. 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA片段的数量和大小而定。当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量,因为上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或弥散,对于较大的DNA片段,此现象更明显。 5. DNA样品中盐浓度会影响DNA迁移率,平行对照样品应使用相同的缓冲条件以消除这种影响。 6. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度、迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率。
展开 |
其他 |
常见问题原因分析 1. 跑出的DNA带模糊? (1)DNA降解:避免核酸酶污染。 (2)电泳缓冲液不新鲜:电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 (3)所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 (4)DNA上样量过多:减少凝胶中的DNA上样量。 (5)DNA样含盐过高:电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 (6)有蛋白污染:电泳前酚抽提去除蛋白。 (7)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 2. 有不规则DNA带迁移? (1)对于λ/Hind III片段cos位点复性:电泳前于65℃加热DNA 5分钟,然后在冰上冷却5分钟。 (2)电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;经常更换电泳缓冲液。 (3)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 3. 跑出的DNA条带弱或无条带? (1)DNA的上样量不够:增加DNA的上样量。 (2)DNA降解:避免DNA的核酸酶污染。 (3)DNA走出凝胶:正确连接电极方向避免插反的情况,缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。 (4)所用光源不合适:对于用EB染色的DNA应用短波长(254nm)紫外光源。 4. 跑出的DNA带缺失不完整? (1)如果是小DNA带,可能跑出凝胶,可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。 (2)分子大小相近的DNA带不易分辨,应延长电泳时间,并核准正确的凝胶浓度。 (3)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
展开 |