RAPD分析技术
实验方法原理 |
RAPD作为单引物的PCR扩增产物,其产生机理是引物首先结合到模板链,沿模板5'端方向延伸而产生不同长度的DNA片段,然后以这些片段为模板继续大量扩增。由于RAPD反应中,在3'端没有相应引物和模板互补,这样必然存在一个由引物沿模板DNA
5'端方向延伸后再在3'端形成同一引物互补序列的过程。
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实验材料 | 模板DNA |
试剂、试剂盒 | 寡核苷酸引物 dNTPs Taq DNA聚合酶 PCR缓冲液 矿物油 电泳所需试剂 |
仪器、耗材 | PCR扩增仪 电泳装置 微量离心机 微量移液器 Eppendorf管 紫外线观察装置及照相设备 |
实验步骤 |
一、 试验条件 1. 药品试剂 (1)模板DNA(10~100 ng) (2)寡核苷酸引物(20 mmol/L贮存液,可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买,也可以自己合成) (3)0.2 mmol/L dNTPs(必须使用高质量的dNTPs,这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解,因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等) (4)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Norwalk,Connecticut) (5)10xPCR缓冲液(500 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2,100 mmol/L Tris HCl,pH 8.3) (7)电泳所需试剂 2. 仪器设备 PCR扩增仪、电泳装置、微量离心机、微量移液器(1~20 ml和20~200 ml)、0.5 ml Eppendorf管、紫外线观察装置及照相设备。 二、 操作程序 水: 14.75 ml 10x缓冲液: 2 ml 10xdNTPs:2 ml 引物(20 mmol/L):0.2 ml Taq DNA聚合酶 终体积 DNA(10~100ng):1 ml 石蜡油 :20 ml 2. 93℃反应2 min后开始如下循环: 93℃变性反应:1 min 36℃退火反应:1 min 72℃延伸反应:1.5 min 经过45个循环后,最后一个循环72℃增加5 min,循环结束后反应产物置于4℃保存。 3. 20 ml反应产物走凝胶电泳,经溴化乙锭染色检测扩增的情况。
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注意事项 |
一、应注意的问题及解决办法 1. 扩增偏差或无扩增。
(1)在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。
(2)PCR抑制物可能与DNA一起纯化,改变DNA的浓度。
(3)在DNA分离中加入一个清洗步骤(如苯酚抽提)。
(4)稀释新的DNA溶液。
(5)引物母液失效。重新配制母液,使用不同的引物或提高引物浓度。
(6)延长退火时间(在PCR程序中的第二部分),或降低升温转换步骤之间的速率。
(7)提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。
(8)补加新的组分,该灭菌的都高压灭菌。
2. 扩增结果差,条带模糊或难以辨认。
(1)更换Taq聚合酶缓冲液。
(2)检查引物(使用另外一个引物,或者将引物末端标记,在16% 6 mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测)。
(3)检查Taq聚合酶活性(与不同批量的酶作比较)。
(4)改变DNA浓度。
3. 高相对分子质量产物弥散状分布>4 kb。
(1)降低DNA浓度。
(2)降低Taq聚合酶浓度。
(3)减少凝胶上样量。
(4)可能是由于循环数过多的结果(Bell和Demarini 1991),减少循环数。
(5)确认是否使用正确的缓冲液(不是水!)制备凝胶。
(6)在较低的电压下电泳。
4. 对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。
确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。
5. 带谱不可重复。
DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10~100 ng范围之内,DNA量太少时,“真正”靶序列与引物的结合效率低,因此引物扩增会产生假的条带,这就称为引物伪迹;DNA量太多会导致错误配对(指引物与基因组DNA的配对)。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。只考虑主要条带。
6. 染色后凝胶背景太强影响分辨率。
(1)减少染色时间。
(2)凝胶脱色时间延长。
(3)PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。
7. 低相对分子质量产物分离不充分。
在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。
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其他 |
1. RAPD主要有以下的自身特点:①无需专门设计RAPD扩增反应的引物,也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序,引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9——10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中,仅加单个引物,通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增,扩增没有特异性。③退火温度较低,一般为36℃,这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对,同时也允许了适当的错误配对,以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR,RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物,得到大量DNA分子标记,可以借助计算机进行系统分析。 2. RAPD分析的优越性和不足,RAPD是一种全新且有效的遗传标记,与其他分子标记相比,具有许多优越之处:①合成一套引物,可用于不同生物基因组的分析。相对来说,RFLP标记具种族特异性,这限制了其应用。②RAPD技术简便易行,省力省时。不需要RFLP分析的预备工作,如克隆制备、同位素标记、Southern印迹和分子杂交。并且RAPD检测灵敏方便,用荧光染料或同位素标记均可检测,这大大增加了其分析速度。即使用序列胶来分析RAPD,单独一人仅用36小时便能完成120个样品的分析,而RFLP至少要花一周时间。③RAPD分析所需样品DNA量极少。仅为RFLP的1/1000-1/200,这对于生物早期取样鉴定或DNA受限制的情况大有益处。④由于RAPD用于构建基因图谱时不需要克隆,这可打破克隆载体和宿主的限制,扩大了应用范围。⑤每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点,这对共同协作的研究项目,可简化信息的转移过程。⑥RAPD标记可以对那些RFLP难以区分的基因组区域作出遗传连锁图。⑦RAPD分析能自动化,减少了象RFLP那样的麻烦手续。
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