DNA片断的酶切实验

DNA片段

TE缓冲液

离心机 恒温水浴 取液器 电泳仪 电泳槽 紫外观测仪

一、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ单酶切及双酶切

1.  取2支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入
 

  A（μl） B（μl） 灭菌水 13 13 EcoR Ⅰ缓冲液 2 0 Hind Ⅲ缓冲液 0 2 λDNA （或质粒DNA ） 4 4 EcoR Ⅰ 1 0 Hind Ⅲ 0 1 总体积 20 20

2.  37℃保温1-4小时。

3.  保温结束后65-70℃10 min 灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）。

4.  取2 μl 左右的反应液加入2 μl 电泳加样缓冲液，电泳。

二、EcoR Ⅰ、Hind III双酶切

1.  取一支干净、灭菌Eppendof管，按下表加入各种试剂
 

加入试剂 体积（μl） 灭菌水 12 MULT buffer 2 λDNA（或质粒DNA） 4 EcoR Ⅰ 1 Hind Ⅲ   1 总体积 20

2.  37℃保温1-2小时。

3.  保温结束后65-70℃10 min 灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）。

4.  取2 μl 左右的反应液加入2 μl 电泳加样缓冲液，电泳。

1.  样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒。

2.  加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。

3.  反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2~1 ug 模板DNA时，应将体积控制在20~30 ul 内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10，因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10，则反应液中甘油浓度将大于5%，而此浓度将抑制内切酶活性。

4.  为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。

单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免活力损失。