实验方法原理 | 本节描述运用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自动DNA 测序仪进行双链DNA 测序的方法。热循环测序反应使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit(#401434)或FS-DNA Sequencing Kit(#402079)进行。操作过程主要根据厂家推荐的方法进行。 |
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实验材料 | PCR 产物 |
试剂、试剂盒 | 琼脂糖 TE 水饱和酚 无水乙醇 70%乙醇 TEMED 测序酶 溴化乙锭 |
仪器、耗材 | 电泳仪 离心管 离心机 冰浴箱 恒温板 DNA 测序仪 |
实验步骤 |
1 混合反应物 (1)取2.5μl 纯化好的PCR 产物[相对于2.5μl 测序试剂盒中的pGEM-3Zf(+)DNA],进行琼脂糖凝胶电泳。 (2)凝胶用溴化乙锭染色,用流水冲洗脱色后,在紫外光下进行照相记录。参照pGEM-3Zf (十)DNA 估测待测DNA 模板的浓度,以确定测序反应中应取的模板量。 (3)在一个标记的 0.5ml Eppendorf 管中,混合以下反应物: DNA 模板 适量 引物(10pmol/ml) 0.5μl 加水至 5.25μl 或6.0μl(FSKit) 100℃下变性2 分钟,再冰浴2 分钟后短暂离心,然后加: DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中测序液 4.75μl 或 FS-DNA Sequencing Kit 中测序液 4.0μl 终体积 10μl (4)用微量取样器将反应物充分混合后,加 20μl 石蜡油覆盖。 2 热循环反应 该反应中降温时间非常关键(约1℃/s)。因此,可使用Perkin-Elmer 序列的热循环仪(PCR 仪,如 480,2400 或 9600)。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 热循环仪。将反应管放入热循环仪中,按以下程序进行热循环反应: (1)96℃ 1 秒钟 96℃ 30 秒钟 (2)50℃ 1 秒钟 50℃ 1 分钟 (3)60℃ l 秒钟 60℃ 4 分钟 共需25 个循环。 3 纯化测序产物 纯化测序产物最好的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱(#CS-901)。操作过程如下: (1)轻弹柱,使Cephadex G-50 胶粉从柱底部扬起。 (2)移去柱上盖,加入 800μl 去离子水,再盖上盖振荡,以除去气泡。 (3)在室温下放置30 分钟,以水化凝胶柱。 (4)移去柱上盖和下盖,将凝胶柱放入一个配置好的洗脱管中,让多余液体流出。 (5)倒去液体,将柱连同洗脱管一起在 3 000r/min 下离心 2 分钟。 (6)将柱放入一个1.5ml 离心管中,用微量取样器将测序反应物取出,注在凝胶柱中央。注意避免带入石蜡油。 (7)3 000r/min 下离心 2 分钟。应注意柱的定向必须与第一次离心时一致。 (8)将样品放在真空干燥离心机中干燥。 (9)将干燥后的样品贮存于―70℃下待进行电泳。在此条件下保存1 年之久的样品其荧光也不会猝灭。 应注意的是,Centri-sep 柱体可反复使用多次。每次使用过后,要用自来水洗3 次,蒸馏水洗 2 次,然后倒置于一试管架上晾干后,称取 50mg Cephadex G-50(Sigma,#9048719)放入其中,即可再行使用。 4 电泳 使用ABI 公司的377 型全自动DNA 序列分析仪电泳,并记录序列数据。控制软件为PRIM377 Collection。电泳过程如下。 (1)聚丙烯酚胺凝胶浓度为4.25%,配制过程如下: 尿素 18g Amberlite 离子交换树脂(Sigma,MB-lA) 约39g 40%Acry mide:Bis(19:1 )(AMRESCO,#0496-500) 5.3ml 去离子水 25ml 将混合液在电磁搅拌器上搅拌10 分钟。 (2)取5ml 10 倍TBE,通过2μm 滤膜抽滤后,再抽滤以上胶液。 10 倍TBE 配方: Tris-base 108g 硼酸 55g Na2 EDTA(2H2O) 7.44g 定容至 1L (3)将滤过液定容至 50ml,加入 35μl TEMED 和 250μl 10%过硫酸胺(APS),轻摇混合后,用50ml 无针头注射器将胶注入已装配好的玻璃板中。 (4)1 小时后,将胶安装于全自动序列仪上预电泳 30 分钟,恒压1kv,并使温度升至 51℃。 (5)预电泳的同时,取出 36 份―70℃下贮存的样品,各加入5μl 载样液(50μl 试剂盒中配备的loading buffer+250μl 去离子甲酰胺,临用前配制)。 (6)将混合液在旋涡混合器上振荡,94℃下变性2 分钟,冰浴2 分钟后短暂离心。 (7)各取 1.5μl 点样,恒压 1.68kv 电泳 7 小时。机器将自动分析和记录序列结果。常有电泳道识别错误的情况,此时应人为修复。
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注意事项 |
Centri-sep 柱体可反复使用多次。每次使用过后,要用自来水洗3 次,蒸馏水洗 2 次,然后倒置于一试管架上晾干后,称取 50mg Cephadex G-50(Sigma,#9048719)放入其中,即可再行使用。
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其他 |
注意测序引物特异性。
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