实验步骤 |
一、材料与设备
1) 脱氧核酶 (其设计与制格参见脱氧核酶相关章节)
2)5X 反应缓冲液:750Tnmol/LNaCl,200 mmol/LTris-HCl (pH8.0)
3)5X 乙酸镁或氯化镁:300 mmol/L
4) 无 RNA 酶的 DMA 酶
5) 切割底物 RNA
6) 无水乙醇
7) 水饱和酚
二、操作方法
1) 脱氧核酶切割底物 RNA 反应体系:加入底物 RNA(终浓度为 1~10umol/L、脱氧核酶 (终浓度为 30umol/L)、反应缓冲液 (终浓度为 15 mmol/LNaCl),4 mmol/LTris-HCl(pH8.0)
2) 于 95°C 加热 3~4 min 从而变性 RNA 底物和脱氧核酶,然后置于冰上 5 min
3) 再于 25℃ 温育 10 min
4) 添加 5X 反应缓冲液,使反应缓冲液的浓度达到 1X 反应缓冲液的浓度. 反应温度提高到 37~42℃
5) 加入 5X 乙酸镁或氯化镁,使镁离子浓度达到 60 mmol/L, 从而启动脱氧核酶的切割反应。
6) 依据底物 RNA 和脱氧核酶的不同,反应时间在 30 min~4 h。
7) 反应结束,将反应管置于冰上,用乙醇沉淀回收 RNA。
8) 如果脱氧核酶千扰后续反应,可在乙醇沉淀后,用 100ul 无 RNA 酶的水溶解,再加 15ulDNA 酶,于 37℃ 反应 lh,酚抽提,乙醇沉淀,再通过变性聚丙烯酰胺凝胶分离纯化。
展开
|