实验步骤 |
一、材料与设备
1) 水浴
2) 杂交炉
3) 电泳设备
4)T4 多核苷酸激酶,AMV 反转录酶
5)10X 激酶缓冲液:5mol/LTris-HCl(pH7.6),0.lmol/LMgCL2,50 mmol/LDTT,lmmol/L 亚精胺.1 mmol/LEDTA
6)5X 杂交缓冲溶液;2 mmol/LNaCl,50 mmol/LPTPES(pH6.4)
7)1X 延伸溶液:
lmol/LTris-HCl(pH8.3) 10ul
120 mmol/LMgCl2 10ul
200 mmol/LDTT 10ul
1 mg/ml 放线菌酮 D 5ul
lOmmol/LdNTP 10ul
RNasin 40U 1ul
加水至 I78ul
8) 甲酰胺上样染液:80% 去离子甲酰胺,45 mmol/LTris-HCl(pH8.3),45 mmol/L 硼酸,1.25 mmol/LEDTA,0.02% 二甲苯青
9)SephadexG-25, 用约 50 倍体积的 TE[10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),1.0 mmol/LEDTA] 重悬 SephadexG-25, 高压灭菌 15 min,冷却后存于 4℃
10) 酵母 tRNA: 浓度为 25 mg/ml,用 DEPC 水配制,注意避免 RNase 的污染,保存于塑料瓶中,存于一 20℃
11)3mol/LNaAc
12)70% 乙醇:用 DEPC 水配制
13)[r-32P]ATP
二、操作方法
(一)用 T4 多聚核苷酸激酶放射性标记引物
1) 将引物溶于水或 TE 缓冲液中,终浓度为 0.4ug/ul,再依次加人下列组分:
引物 1〜5pmol(0.4ug)
10X 激酶缓冲液 1ul
[γ-32P]ATP 35uCi(3000Ci/mmolL)
T4 多聚核苷酸激酶 20U
DEPC 水补足 10ul
2) 混合并于 37℃ 温育 0.5〜lh,加入 250 mmol/LEDTA 终止反应
3) 用 TE 将总体积加至 100ul。通过 SephadexG-25 柱将未标记的引物从激酶化的引物中分离出来,收集第一个放射活性峰,65℃ 温育 l0 min 以灭活了 T4 多聚核苷酸激酶
4) 用等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 抽提,向水相中加入 NaAc 和 MgCl2
至终浓度分別为 0.3mol/L 和 5 mmol/L, 并加入 lOugtRNA。加入 2.5 倍体积的无水乙醇. 放在干冰中 10
min,12000 g 4℃ 离心 30 min, 用 70% 的乙醇离心洗涤沉淀. 将沉淀干燥并重溶于 80ul 无菌水中
(二)杂交
1) 在微量管中,混合下列组分:
靶 RNA 0.1〜5fmol(最多为 20ug 的总 RNA)
SX 杂交缓冲液 4ul
标记的引物 1〜50fmol
加水至 20ul
2) 于 70℃,温育 3 min
3) 在 54℃ 杂交 1.5〜4 h
(三) 延伸反应
1) 样品屮加入 178ul 延伸缓冲液,置与冰上
2) 加入 lul RNasin 和 1ul 反转录酶,42°C: 保温 lh
3) 加入 20ul 和 2.5 倍体积的无水乙醇,在干冰中放置 10 min,12000g 离心 15 min, 用 70% 乙醇离心洗涤,空气干燥 2 min
4) 用甲酰胺上样染液重悬沉淀,注意要充分混匀。
5)90℃ 热变性 3 min, 然后置于冰上
6) 将 8ul 样品上样于变性聚丙烯酰胺凝胶,同时加入 DNA 分子质量标准物后进行电泳
展开
|