一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
丙酮
蒸馏水
干冰
磷酸盐缓冲液(PBS)
Tek OCT 组织复合物(Sakura FinetekUSA,Torrance,CA)
2. 特殊设备
封闭容器
烧杯
恒冷装置
解剖工具
平盘
可以削去的一次性组织模子(Pelco International,Redding,CA)
普通的无粘片剂的载玻片
Sakura 刀片(IMEB,SanMarcos,CA)
3. 细胞和组织
新鲜的组织(见二、方法中的(2))
二、方法
1. 冷冻组织的准备
(1) 盖上盛有包埋介质的模子(推荐使用 Tek O C T 组织复合物),准备干冰-丙酮浴(在烧杯中简单混合干冰和丙酮)。
(2) 处死动物并取出目的组织与包埋介质混合。
(3) 放组织于冷模子底上。为了便于利用恒冷装置,反向放目的切面于冷模子底上。
(4) 将冷模子的底部放于干冰-丙酮浴的表面,这样样品将在 3~4 min 内逐渐冷却。当品冷冻后将呈现白色。在冷冻时不要将模子掉入丙酮中。
(5) 从模子中移去组织,放于-80°C 直到切片。如果组织样品放置时间较长,将其放盛有冷的蒸馏水的密封容器中以保持湿度。
2. 切片及保存
(1) 取冷冻的样品置于含 O C T 复合物的低温冷箱中,采用标准的冷冻组织切片法。
(2) 让样品与冷箱中温度(-25~-20°C) 平衡 15~20 min。如果样品在切片时组织块太冷,平衡时间可以适度延长。
(3) 将准备用于 LCM 的切片(厚度 1~5um) 放于普通的无粘片剂的载破片上。如果组织粘于载玻片上太紧,可能不利于后续的 LCM 操作。
(4) 放置好后,立即放到干冰上。如果当天做 LCM,片子应当放在干冰上。否则,应储存于-80°C。
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