方案1 双向凝胶电泳鼠肝蛋白质提取物的制备实验
方案2 双向凝胶电泳真核生物细胞裂解物的制备实验
方案3 双向凝胶电泳大肠杆菌裂解液的制备实验
方案4 双向凝胶电泳脑脊液蛋白样品的制备实验
方案5 第一向:蛋白质的等电聚焦电泳实验
方案6 垂直 SDS 平板凝胶的制备:均一凝胶的灌制实验
方案7 垂直SDS 平板凝胶制备:同时灌制多梯度凝胶实验
方案9 第二向:蛋白质的 SDS-PAGE 实验
方案10 胶体考马斯亮蓝染色实验
方案11 银氨染色
方案12 与质谱兼容的银染法实验
方案13 用 SYPRO Ruby 进行荧光染色
方案14 用 GelCode 磷蛋白染色试剂盒对磷蛋白进行染色实验
方案15 双向凝胶的槽式转移实验
方案16 双向凝胶的半干印迹实验
方案17 用丽春红 S 染色膜上的蛋白质
方案18 用考马斯亮蓝 R250 染色膜上的蛋白质
方案19 用印度墨水染色膜上的蛋白质
方案20 用胶体金染色膜上的蛋白质
实验方法原理 | 肝与其他动物组织一样,可制备用作双向电泳的材料。离心之后,溶于合适的溶液中即可。不需要浓缩蛋白质或去除干扰物质等额外步骤。所用抽提溶液包括脲、硫脲和酰胺烷基硫代甜采碱去垢剂ASB-14,它们配合使用可最大量地溶解蛋白质。 |
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实验材料 | 鼠肝 |
试剂、试剂盒 | 二硫苏糖醇(DTT) 抽提溶液 苯甲基硫酰氟(PMSF) |
仪器、耗材 | 液氮 低温离心机 研钵和研杵 |
实验步骤 |
1.取一些肝放入研钵中,如果事先没有被冰冻,可用液氮充满研钵来保持肝冰冻。用研杵将肝破碎成小块。
2.称量冰冻肝的小块 10~40 mg,将其转移至在冰上放置的离心小管中。操作应迅速以尽可能减少肝样品的解冻。将剩余的肝储存在一 80°C。
3.在有肝样品的离心管中,每 40 mg 肝加入 1ml 冷的抽提溶液。每 1ml 抽提溶液加 100 mmol/L PMSF。
4.用小研杵(其大小适合在离心管中使用)磨碎肝样品。
5.每 1ml 抽提物中加 50ul 1.2mol/L DTT,振荡。
6.在 4°C 对样品进行最大速度离心,lOmin。
7.检测上清的蛋白质浓度。
8.将上清分成每 100ul —份。若不立即用于 IEF,将其储存在一 80°C(样品只能冻融一次,以避免多次冻融造成的不利影响)。
9.按照方案 5 进行第一向 IEF。
进行第一向 IEF 时,以鼠肝为例,浓度应为 5~lOmg/ml。对第一向 IEF,样品可在包含 7mol/L 脲、2mol/L 硫脲、20 g/LASB-14 的水化液中被稀释成准确浓度。但是,若在水化的同时上样,IEF 胶条可负载相当大体积的样品。最适水化溶液可根据蛋白质来源和经验而灵活决定。
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