基本方案
实验方法原理 |
丙烯酰胺的聚合已经应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),也应用于酶的包埋。长的聚合物链通过交联 N,N'-亚甲基二丙烯酰胺连接而成(图 1)。聚合反应是通过N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵引发的。通过改变交联剂的数量,可以控制聚合物网孔尺寸,以此确定酶被固定而底物和产物能从催化位点自由地扩散。
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实验材料 | 酶溶液 |
试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺 NN'-甲基丙烯酰胺 NNN'N'-四甲基乙二胺 过硫酸铵 Tris-HCl 磷酸钾 |
仪器、耗材 | 高速搅拌器 |
实验步骤 |
实验所需「试剂」具体见「其他」 在 8 ml 的酶溶液中,加入 1.5 g 的丙烯酰胺、80 mg 亚甲基二丙烯酰胺、10 ul 四甲基乙二胺和 30 ul 10% 过硫酸铵。反应的混合物被控制在 37℃,还必须避免温度的升髙。聚合在 20 min 内发生。然后,用抹刀把凝胶切割成小片,再添加 10 ml pH 7.5 0.1 mol/L 磷酸钾缓冲液,凝胶粒子被高速搅拌器进一步地磨碎。凝胶微粒在玻璃料上被冲洗三次,之后直接用于酶的测试。
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注意事项 | |
其他 |
试剂: 丙烯酰胺(Mr=71.1) N,N'-甲基丙烯酰胺(Mr=154.2) N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED,Mr=116.2) 过硫酸铵(过硫酸铵 Mr=228.2,10% 水溶液,新鲜配制) 0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.2 0.1 mol/L 磷酸钾,pH 7.5 0.1 mol/L 酶溶液(8 mg 溶于 8 ml 0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.2)
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