实验方法原理 |
1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。 |
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实验材料 | 小鼠 骨髓瘤细胞 |
试剂、试剂盒 | NCS |
仪器、耗材 | CO2孵箱 培养板 |
实验步骤 |
一、细胞融合前准备
1. 免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
(1)颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案
初次免疫 1×107/0.5 ml ip (腹腔内注射) ↓ 2~3周后 第二次免疫 1×107/0.5 ml ip ↓ 3周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5 ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合
(2)可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50 μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.8~1 ml 0.2 ml/点) ↓3周后 第二次免疫 剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(ip剂量不宜超过0.5 ml) ↓3周后 第三次免疫 剂量同上,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价,检测免疫效果) ↓2~3周后 加强免疫,剂量50~500 μg为宜,ip或iv ↓3天后 取脾融合
目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如
2. 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存,随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备
小鼠采用与免疫小鼠相同的品系,常用BaLb/c小鼠6~10 周龄 ↓ 拉颈处死,浸泡于75 %酒精,消毒3~5 分钟 ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入6~8 ml培养液 ↓ 反复冲洗,吸出冲洗液 ↓ 放入10 ml离心管,1200 转/分离心5~6 分钟 ↓ 用20 %小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬,调整细胞数1×105 /ml ↓ 加入96孔板,100 μl/孔 ↓ 放入37 ℃,CO2孵箱培养
一般饲养细胞在融合前一天制备,一只小鼠可获得5~8×106 腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为5×106 /ml,小鼠脾细胞为1×106 /ml,小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105 /ml,均为100 μl/孔。
3. 骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有:NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液,如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10~20 %,细胞的最大密度不得超106 /ml,一般扩大培养以1∶10稀释传代,每3~5 天传代一次。细胞的倍增时间为16~20 小时,上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,为确保该细胞对HAT的敏感性,每3~6月应用8~AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次,以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期,良好的形态,活细胞计数高于95 %,也是决定细胞融合的关键。
4. 免疫脾细胞
免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞和浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏,制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例较大,融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备
二、细胞融合,选择杂交瘤
1. 细胞融合流程
(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0,1000 rpm离心5 分钟,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数,用不完全培养液洗涤2 次。
(2)同时制备免疫脾细胞悬液,用不完全培养液洗涤2 次。
(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50 ml塑料离心管内不完全培养液洗1 次,1200 rpm,8分钟。
(4)弃上清,用滴管吸净残留液体,以免影响PEG的浓度。
(5)轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动。
(6)在室温下融合
①30 秒内加入预热的1 ml45 %PEG(Merek,分子量4000)含5 %DMSO,边加边搅拌。 ②作用90 秒钟,若冬天室温较低时可延长至120 秒钟。 ③加预热的不完全培养液,终止PEG作用,每隔2 分钟分别加入1 ml,2 ml,3 ml,4 ml,5 ml和10 ml。
(7)离心,800 rpm,6 分钟。
(8)弃上清,先用6 ml左右20 %小牛血清RPMI1640轻轻混悬,切记不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开。
(9)根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,10 ml一块96孔板。
(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100 μl/孔,37 ℃、5 %CO2孵箱培养。
一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
2. HAT选择杂交瘤
一般在融合24 小时后,加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存,用时1 ml加入50 ml20 %小牛血清完全培养液中。
因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞,200 μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为,融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择,可得到满意的筛选结果。
50×HAT H: 5×10-3M A: 2×10-5M T: 8×10-4M
一般选择HAT选择培养液维持培养两周后,改用HT培养液,再维持培养两周,改用一般培养液。
三、抗体的检测
筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有
1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。
2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
3. FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
上述方法均为一般实验室的常规方法,故在此不介绍具体的实验过程。
可靠的筛选方法必须在融合前建立,避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
四、杂交瘤的克隆化和冻存 克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。
1. 克隆化方案 用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
(1)有限稀释法的程序 ①制备饲养细胞悬液(同融合前准备) ②阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103 /ml ③取130
个细胞放入6.5 ml含饲养细胞完全培养液,即20 个细胞/ml,100 μl/孔加A、B、C三排为每孔2 个细胞。余下2.9
ml细胞悬液补加2.9 ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10 个/ml,100 μl/孔加D、E、F三排,为每孔1 个细胞。余下2.2
ml细胞悬液补加2.2 ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5 个/ml,100 μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5 个细胞。 ④培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200 μl/孔。 ⑤第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。 注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
(2)软琼脂法 ①软琼脂的配制 含20 %FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640 1 %琼脂水溶液:高压灭菌,42 ℃预热。 0.5 %琼脂:由1份1 %琼脂加1份含20 %小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42 ℃保温。
2. 杂交瘤细胞的冻存
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。
细胞冻存液: 50%小牛血清 40%不完全培养液 10%DMSO(二甲亚砜)
冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0 ℃,再降温时一般按每分钟降温2~3 ℃,待降至-70 ℃可放入液氮中。或细胞管降至0 ℃ 后放-70 ℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
五、单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种
1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10~60 μg/ml,如果大量生产,费用较高。
2. 体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。
(1)实体瘤法
(2)腹水的制备
六、单克隆抗体的鉴定
对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定
1. 抗体特异性的鉴定
2. McAb的Ig类与亚类的鉴定
3. McAb中和活性的鉴定
4. McAb识别抗原表位的鉴定
5. McAb亲和力的鉴定
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注意事项 |
一、影响因素、失败原因分析
由于制备McAb的实验周期长,环节多,所以影响因素就比较多,稍不注意就会造成失败。
其主要失败原因和影响因素有
1. 污染
2. 融合后杂交瘤不生长
3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
三要 要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。 要定期进行再克隆。 不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势,压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。 不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。 不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。
4. 杂交瘤细胞难以克隆化 可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关,或由于细胞有支原体污染,使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化,应在培养液加HT。
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