材料: 无菌 生长液: 胰蛋白酶(0.25% + EDTA ,1 mmol/L ,溶于 PBSA 中) MTT : 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2, 5-二甲苯基溴化四唑,50 mg/m l, 滤过, 除菌。 Sorensen 甘氨酸缓冲液(0.1 mol/L 甘氨酸,0.1 mol/L, NaC l,用 1 mol/L Na(OH) 将 pH 调至 10.5) 微滴定板(Iwaki) 微量吸头,最好放在高压灭菌的吸头盒中 5 cm 和 9 cm 培养皿(未经 T C 处理的)或储液器(Corning) 30 ml 和 100 ml 通用容器或试管 非灭菌 塑料盒(无毒的聚苯乙烯,装培养板用) 多道加样器 二甲基亚砜 (DMSO) DMS( ) 分装器:Labsystems Microplate Dispenser (Cat No 5840127,Thermo Electron) ELISA 读板仪(Molecular Devices,with SOFT max PRO ; 见附录Ⅱ ) 离心用的板架(用于悬浮生长的细胞) 操作步骤 接种细胞 1. 用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞,将细胞收集到含血清的培养基中。 2. 离心细胞悬液(5 min ,200 g ),使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞,计数。 3. 将细胞稀释至 2.5 X103~50 X103 个/ml,这要依细胞系的生长速度而定,每个微滴定板可以容纳 20 ml 细胞悬 液。 4. 将细胞悬液移至 9 cm 培养皿中,用多道加样器在平底 96 孔板中间 10 列的各孔中加人 20 ul 细胞悬液(每板 80 孔),从第 2 列开始到第 11 列为止,每孔加入 0.5X 103~10X 103 个细胞 5. 将 200ul 培养基加至第 1 列与第 12 列的 8 个孔中。第 1 列用作读板仪的空白对照,第 12 列有助于维持第 11 列的湿 度,并将「边缘效应」(edge effect) 减至最小。 6. 将培养板放至塑料饭盒中,于 37℃:湿润环境中温育 1~3 d ,等细胞进入指数生长期时可加入药物。 7. 对于非黏附细胞,用新鲜培养基制备细胞悬液,将细胞稀释至每毫升 5X 103~100X 103 个/m l,仅取 100 ul 细胞 悬液接种于圆底 96 孔板,之后立即加入药物。 添加药物
8. 用培养基将细胞毒性药物 5 倍系列稀释,共制备 8 个浓度。选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死,而最低
浓度时不会杀死细胞为标准。只要对药物的毒性有所了解,便可采用较小的浓度范围。一般情况下,每种药物使 用 3
块培养板,这样一次试验中可以有三个平行测定结果。 9. 对于贴壁生长的细胞,去除第 2-11 列各孔中的培养基,这可以通过将皮下注射器针连在吸引管上完成。 10. 在第 2 列和第 11 列的 8 个孔中加人 200^1 新鲜配制的培养基,这些细胞作为对照。 11. 在第 3~10 列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需 4 个孔,这样 A-D 行可用于第一种药物,E ~H 行用于第二种药物。 12. 将药物溶液移至 5 cm 培养皿中,用 4 道加样器向每组的 4 个孔中各加入 200 ul。 13. 将培养板放回塑料盒中,温育至确定的暴露时间。对于非黏附细胞,将药 物稀释至预期终浓度的 2 倍,取 100^1 加入已含 100^1 细胞的孔中。 生长期 14. 在药物暴露期结束时,去除所有含有细胞的孔中的培养基,加入 200 ul 新鲜的培养基。若是非黏附细胞,离心培 养板(5 min ,200 g ),使细胞沉淀下来。然后用细针头吸去培养基,不要扰动细胞团。 15. 每日换液至 2~3 个 P D T 。 存活细胞数的估算 16 . 在生长期末,每孔中各加人 200 ul 新鲜的培养基,在第 1-11 列所有孔中各加人 50 ul MTT 。 17. 以铝箔包裹培养板,于 37℃湿润环境中温育 4 h 。请注意 4 h 是所需的最短温育时间,可延至 8 h 。 18.. 弃去孔中的培养基和 (非黏附细胞则离心),在第 1-11 列所有孔中各加入 200ul DMSO , 以溶解残留的 MTT - 甲腊结晶。 19. 在含 DMSO 的各孔中加人甘氨酸缓冲液(每孔 25 ul )。 20. 立即在 570 nm 处记录吸光值,因为产物不稳定。读板仪用第 1 列中含培养基和 MTT 但不含细胞的各孔调零。 MTT 试验分析 21. 以药物浓度为横坐标(X 轴),吸光值为纵坐标(Y 轴)绘制曲线图。 22. 第 2 列和第 11 列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值,对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为 IC50 浓 度。偶尔结果并非如此,这表明整个板中所接种的细胞数不一致之故。 23. 得到吸光值的绝对值,以此作图,这样才能与对照吸光值比较,然后要将数据转化成百分率抑制曲线 (图 22.6), 从而使一系列曲线标准化。
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