基本方案
实验材料 | 杆状病毒 |
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试剂、试剂盒 | TE 蛋白酶K N-十二烷基肌氨酸 苯酚 氯仿 异戊醇 乙醇 乙酸钠 |
仪器、耗材 | 培养瓶 锥形瓶 转子 离心机 聚苯乙烯管 |
实验步骤 |
1. 以每1.8x107细胞的密度接种Sf9细胞于至少10个150 cm2 培养瓶中。27℃温育约2 h,让细胞牢固贴壁,以0.1的感染复数用野生型AcMNPV感染。当观察到多数细胞中含有包涵体时,将病毒上清(约200 ml)转移至4个50 ml 锥形管中。
2. 4℃ 1 000 g 离心10 min,将病毒上清倒入4个新的管子中。重复离心以去除所有残留细胞。
3. 将病毒上清置于SW-27超离心管中,平衡后于4℃,100 000 g 离心30 min,收集病毒。倾倒出上清,将管子倒扣于Kimwipe纸巾上,尽可能倒干液体。
用蔗糖梯度分离纯化病毒团块:
5a. 加入1 ml 0.1xTE缓冲液,反复上下吹打重悬病毒沉淀。如果沉淀难以重悬,则于4℃温育过夜。
微量离心纯化病毒沉淀块:
5b. 加入3 ml 抽提缓冲液,反复上下吹打重悬病毒沉淀。如果难以重悬,则于4℃温育过夜。
6b. 分别转移1.5 ml 病毒悬液于两个1.5 ml 微量离心管中。最大速度下微量离心5 min,上清转移至一个15 ml 聚苯乙烯离心管中。
8b. 在最大速度下微量离心5 min,将两份上清与15 ml 聚丙烯管中的上清液合并。
10. 用9 ml 抽提缓冲液重悬沉淀,分成4.5 ml 的两小份移至2个15 ml 聚丙烯离心管中。
12. 每管各加入0.5 ml 10%N-十二烷基肌氨酸钠,50℃温育2 h或过夜。
13. 用等体积的25:24 : 1的酚/氯仿/异戊醇抽提DNA两次。
14. 用一宽嘴(5~10 ml)吸管将含有DNA的水相转移至另一个15 ml 聚丙烯管中。加10 ml 100%的乙醇,倒转离心管数次,轻柔混合,于-80℃放置10 min。
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