从培养的细胞中分离Ⅰ~Ⅲ型中间丝
从组织中分离中间丝
实验材料 | 细胞 |
---|---|
试剂、试剂盒 | 蛋白酶抑制剂 裂解缓冲液 解聚缓冲液 组装缓冲液 |
仪器、耗材 | 匀浆器 |
实验步骤 | 1. 从培养皿或瓶中吸去培养基并用 5 ml 含蛋白酶抑制剂的冰冷的 PBS 洗细胞。 2. 每 75cm2 瓶或培养皿用 1 ml 冰冷的裂解缓冲液 5 分钟裂解细胞。 裂解缓冲液: 在 PBS 中加入: 1% Triton -X-100 0.6 mol/L KCl 10 mmol/L MgSO4 3. 每 ml 细胞裂解液加 0.5 mg DNA 酶Ⅰ,4℃ 冰浴 5 分钟或冰浴至细胞裂解物的黏滞度明显降低。 4. 4℃ 下以 1500 g 离心裂解物 10 分钟。 5. 用含有蛋白酶抑制剂并且含 5 mmol/L EDTA 的 PBS 洗沉淀物两次。 6. 沉淀物在解聚缓冲液中混匀(蛋白终浓度应该大约为 1 mg/ml)并在 20℃ 搅拌 30 分钟。 解聚缓冲液: 10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0 8 mol/L 尿素 0.2% β-巯基乙醇 5 μmol/L EDTA 7. 匀浆了的沉淀物在 20℃ 以 200000 g 离心 30 分钟。 8. 用适当的组装缓冲液透析上清(蛋白浓度应该大概为 0.5 mg/ml ) 来促进中间丝的组装。Ⅰ型和Ⅱ型或者Ⅲ型中间丝至少在 20℃ 透析 3 小时。 用于Ⅰ型和Ⅱ型中间丝蛋白(角蛋白)的组装缓冲液: 10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4 0.2% β-巯基乙醇 用于Ⅲ型中间丝蛋白的组装缓冲液: PBS 9. 透析了的制品在 4℃ 以 100000 g 离心 30 分钟,回收聚合了的中间丝沉淀物。 10. 重复 2 或 3 次步骤 6~9 以减少除中间丝蛋白或中间丝相关蛋白以外蛋白质的量。 |