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细胞冻存与复苏知识

2020.4.04
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

细胞冻存的好处


所以这看似小小的一步,其实非常重要啊!

细胞冻存的基本原理:


细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与,而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃ 以下时会集体罢工,使代谢活动近乎停止,细胞因此进入睡美人状态,使细胞「不会老」,所以可以长期保存。冷冻凝固的过程中,水分会在 0℃~-20℃ 区间形成不同形状的结晶「下图 1」,因此在细胞冻存时「降温速度、冰晶形成量和细胞渗透压改变程度」是影响冻存成功与否的重要关键。

▲图1:0℃~-20℃ (红色区),冰晶生成量最多。(Fesenmaier,2011)

■ 降温速度慢:冰晶由细胞外开始形成,造成胞外渗透压变小,细胞内水份移动至细胞外,造成细胞脱水皱缩。
■ 降温速度快:水分流动时间短,细胞内外渗透压改变程度小,但大量水分留在细内造成大量胞内冰晶形成,使胞器损坏。

这些影响都会让细胞损伤、细胞凋亡或坏死,也可能造成复苏后细胞存活率低、细胞形态改变、细胞功能丧失、基因或蛋白质组分变异等现象。由此可知,最适合的冻存条件为「在增加细胞渗透压稳定性的溶液中,以慢到能减少胞内冰晶形成、但也足够快到能预防细胞脱水的降温速度冻存细胞」「下图2」。

▲图2:降温速度对细胞造成的影响
 

最温柔的冻存液:


细胞冻存液体中的「抗冻剂」是维持细胞渗透压平衡的关键,常见的成分有 DMSO、甘油等。这些成分能在细胞冷冻悬液完全凝固之前,渗透到细胞内,平衡细胞内外的渗透压,避免细胞过分脱水皱缩、也能同时减少细胞内冰晶的形成;但这类成分对细胞有一定的毒性,所以需要使用高浓度血清来保护细胞,使冻存成本升高。而目前市面上常见的无血清细胞冻存液,会是对细胞最温柔的替代选择。
 

刚刚好的冻存方法:


上课快迟到时,嫌公交车速度太慢;送暧昧对象回家时,嫌走路速度太快。到底怎样的降温速度对细胞最好? 经研究证实:最佳降温速度为 -1℃/分钟;以下介绍三种常见冻存方法:


快狠准地叫醒细胞:


将冻存在-196℃ 液态氮中的细胞冻存管快速移至已 37℃ 预热的水浴锅中(水面需低于管口,避免水分意外进入冻存管),使细胞冷冻悬液迅速融化;此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃ 这个结晶形成温度范围(图 1),使冻存时细胞外的冰晶迅速融化,避免冰晶进入细胞形成再结晶,对细胞造成二次伤害。细胞复苏速度太慢,就会像舰长一样「醒来却一身病」,电影全程出现不到半小时就下去领盒饭啦!

Reference


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