5.电泳
操作步骤:
1)将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合,10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀;2)用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部,注意不要溢出来。注意:对于考马斯亮蓝染色液来说,每个泳道10-30ug的蛋白混合粗提物(我们俗称粗抗原)或者5-10ug单一蛋白组分是较合理的上样浓度。
电泳液:
1)上槽中加入阴极电泳液(20mM氢氧化钠:须由1M储存液新鲜配置);
2)下槽中加入阳极电泳液(10mM磷酸:须由1M储存液新鲜配置)。
等电聚焦电泳条件:
1)接好电极;
2)恒压150V电泳30min;
3)恒压200V电泳2.5h,开始时候控制电流为10mA左右,在聚焦过程中电流有所下降,电泳内室温度在电泳的过程中将升至40-50摄氏度。
6.电泳聚焦后处理
测定pH梯度:
1)将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片;
2)将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中 浸泡30min;
3)测读此KCl溶液的pH值、
凝胶的固定:
1)将凝胶于10%三氯乙酸中浸泡10min;
2)换成1%三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上,以去除载体两性电解质,浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。
凝胶的染色:用考马斯亮蓝染色,然后脱色,制成干胶。
7.天然等电聚焦电泳的修正方案
如果要进行天然等电聚焦电泳,要做一些修改;
1) 胶过程中配的凝胶中不需要加尿素;
2)上样缓冲液(2×)5ml:其中1.8ml水,200μl载体两性电解质(同制胶成分),3ml甘油,上样时候于等体积样品混匀,10000×g离心5敏即可上样;
3)室温下电泳,接好电极,恒压下先200V电泳1.5h,再400V电泳1.5h。