CY3标记反应原理:
Reactive CY3专一的与伯胺反应(N-末端及赖氨酸残基侧链)形成稳定的酰胺键
操作过程:
实验前准备:
仔细阅读使用说明书。
计算待使用Reactive CY3的量。
提前20 min从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温(注:不需要用到的Reactive CY3继续放置冰箱中)。
溶解Reactive CY3:加入20 μL DMF至Reactive CY3瓶中,静置10 min,待其充分溶解,此时CY3的浓度为10 mM。
操作步骤:(本操作步骤按照1 mg的量进行标记)
取1 mg待标记抗体于Filtration tube中,并加入相应体积的 Labeling Buffer至总体积为0.5 mL,12,000× g离心10 min。(注:①Filtration tube的最大体积为0.5 mL。②待标记抗体浓度低时,可先超滤离心一次。)
加入13.3 μL Reactive CY3 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中,使抗体的终浓度为2 mg/mL,并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育60 min。
12,000 × g离心10 min。
加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中,使终体积为0.5 mL,并轻轻吹打混匀,12,000×g离心10 min。并重复操作一次。
加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中,轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中,6,000×g离心10 min。
收集离心管中的溶液,即为CY3标记的抗体。
注意事项:
本试剂盒也可标记其它含有氨基(NH2-)的抗原、HRP、多肽,具体标记比例根据待标记物中氨基的数量确定。
DMF要密封干燥保存,使用完立即用封口膜封紧。
操作步骤5中,可用Labeling Buffer作为回收标记抗体的缓冲液,也可使用其它任何缓冲液或保护剂。
本试剂盒未开封前的有效期为一年,请在有效期内使用。
本试剂盒提供的为10 kDa的Filtration tube,标记抗原或多肽请注意分子量的大小。
在步骤2中,标记其它抗体时,我们应先控制抗体的终浓度为2 mg/mL,然后再根据抗体的量计算应加入Reactive CY3的体积。
要确定在偶联中不引入游离氨基(Tris,氨及叠氮钠均。